Бимолекулярная комплементация, аффинная очистка для выделения двух взаимодействующих белков

Чтобы обнаружить и изолировать пару специфических взаимодействующих белков с помощью аффинной очистки бимолекулярной комплементации, добавьте пару смеси плазмид бимолекулярной флуоресценции комплементации и трансфективного агента в культуральную пластину, содержащую клетки млекопитающих.

Одна плазмида кодирует один взаимодействующий белок — белок-приманку — слитый с фрагментом флуоресцентного белка репортера. Другая плазмида кодирует другой связывающий белок — белок-жертву — слитый с комплементарным фрагментом флуоресцентного белка.

инкубировать. Трансфективный агент способствует поглощению плазмидными клетками. Успешно трансфицированные клетки экспрессируют локализованные в клеточной мембране белки.

Взаимодействие белков приманки и добычи сближает фрагменты флуоресцентного белка. Это приводит к тому, что фрагменты сливаются и сворачиваются, образуя функциональный флуоресцентный белок, флуоресценцию которого можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом.

Замените среду на неионогенный буфер для лизиса, содержащий детергент, чтобы разрушить клеточные мембраны, высвобождая гибридные белки. Соберите лизат клеток в пробирку. Центрифуга.

Переложите надосадочную жидкость, содержащую фьюжн-белок, в свежую пробирку. Добавьте шарики агарозы, конъюгированные с однодоменным антителом, нацеленным на флуоресцентный белок, нанотелом, которое распознает и связывается с трехмерным эпитопом на свернутом флуоресцентном белке.

центрифуга. Ресуспендируйте связанные с белками афьюжн агарозные шарики в буфере. Нагрейте для диссоциации белков слияния с шариками агарозы. Выполните SDS-PAGE для разделения отдельных белков с последующим вестерн-блоттингом антителами, специфичными для флуоресцентных белковых фрагментов.

Обнаруживаются только взаимодействующие белки, помеченные флуоресцентными фрагментами, что подтверждает их выделение.

Сначала семена HEK293T клетки в 10-сантиметровую посуду, содержащую 10 миллилитров ДМЭМ. Затем разведите по 2,5 мкг каждого вектора комплементации бимолекулярной флуоресценции в 500 микролитрах трансфекционного буфера.

Добавьте 10 микролитров реагента для трансфекции, и перемешайте смесь в течение 10 секунд. Затем кратковременно центрифугируйте образцы и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте смесь для трансфекции ДНК по каплям в чашку. Затем инкубируйте образцы в течение 8-24 часов.

Подготовьте буфер для лизиса клеток и буфер для дополнительного лизиса клеток, как указано в текстовом протоколе. Затем дважды промойте клетки ледяным PBS. Аспирируйте PBS и добавьте 1 миллилитр ледяного буфера для лизиса клеток.

Далее поставьте блюдо на лед, и выдержите в течение пяти минут. Затем с помощью скребка для клеток удалите клетки и перенесите их в охлаждаемую микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при 18 000-кратном давлении в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Затем переложите прозрачную надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку.

Постирайте соответствующий объем агарозных бусин в 1 миллилитре PBS. Затем центрифугируйте шарики при 300-кратном давлении и осторожно удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте в каждый образец по 20 микролитров шариков агарозы, и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия в течение двух часов при вращении встык.

Центрифугируйте шарики при 300-кратной плотности и промойте их в буфере для лизиса клеток три раза. Затем повторно суспендируйте промытые шарики в 50 микролитрах разбавленного образца буфера. Наконец, нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение двух-трех минут.