Бимолекулярная комплементация, аффинная очистка для выделения двух взаимодействующих белков

Чтобы обнаружить и изолировать пару специфических взаимодействующих белков с помощью аффинной очистки бимолекулярной комплементации, добавьте пару смеси плазмид бимолекулярной флуоресценции комплементации и трансфективного агента в культуральную пластину, содержащую клетки млекопитающих.

Одна плазмида кодирует один взаимодействующий белок — белок-приманку — слитый с фрагментом флуоресцентного белка репортера. Другая плазмида кодирует другой связывающий белок — белок-жертву — слитый с комплементарным фрагментом флуоресцентного белка.

инкубировать. Трансфективный агент способствует поглощению плазмидными клетками. Успешно трансфицированные клетки экспрессируют локализованные в клеточной мембране белки.

Взаимодействие белков приманки и добычи сближает фрагменты флуоресцентного белка. Это приводит к тому, что фрагменты сливаются и сворачиваются, образуя функциональный флуоресцентный белок, флуоресценцию которого можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом.

Замените среду на неионогенный буфер для лизиса, содержащий детергент, чтобы разрушить клеточные мембраны, высвобождая гибридные белки. Соберите лизат клеток в пробирку. Центрифуга.

Переложите надосадочную жидкость, содержащ