Бимолекулярная комплементация, аффинная очистка для выделения двух взаимодействующих белков
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 4:29 мин • July 8th, 2025
Чтобы обнаружить и изолировать пару специфических взаимодействующих белков с помощью аффинной очистки бимолекулярной комплементации, добавьте пару смеси плазмид бимолекулярной флуоресценции комплементации и трансфективного агента в культуральную пластину, содержащую клетки млекопитающих.
Одна плазмида кодирует один взаимодействующий белок — белок-приманку — слитый с фрагментом флуоресцентного белка репортера. Другая плазмида кодирует другой связывающий белок — белок-жертву — слитый с комплементарным фрагментом флуоресцентного белка.
инкубировать. Трансфективный агент способствует поглощению плазмидными клетками. Успешно трансфицированные клетки экспрессируют локализованные в клеточной мембране белки.
Взаимодействие белков приманки и добычи сближает фрагменты флуоресцентного белка. Это приводит к тому, что фрагменты сливаются и сворачиваются, образуя функциональный флуоресцентный белок, флуоресценцию которого можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом.
Замените среду на неионогенный буфер для лизиса, содержащий детергент, чтобы разрушить клеточные мембраны, высвобождая гибридные белки. Соберите лизат клеток в пробирку. Центрифуга.
Переложите надосадочную жидкость, содержащую фьюжн-белок, в свежую пробирку. Добавьте шарики агарозы, конъюгированные с однодоменным антителом, нацеленным на флуоресцентный белок, нанотелом, которое распознает и связывается с трехмерным эпитопом на свернутом флуоресцентном белке.
центрифуга. Ресуспендируйте связанные с белками афьюжн агарозные шарики в буфере. Нагрейте для диссоциации белков слияния с шариками агарозы. Выполните SDS-PAGE для разделения отдельных белков с последующим вестерн-блоттингом антителами, специфичными для флуоресцентных белковых фрагментов.
Обнаруживаются только взаимодействующие белки, помеченные флуоресцентными фрагментами, что подтверждает их выделение.
Сначала семена HEK293T клетки в 10-сантиметровую посуду, содержащую 10 миллилитров ДМЭМ. Затем разведите по 2,5 мкг каждого вектора комплементации бимолекулярной флуоресценции в 500 микролитрах трансфекционного буфера.
Добавьте 10 микролитров реагента для трансфекции, и перемешайте смесь в течение 10 секунд. Затем кратковременно центрифугируйте образцы и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавьте смесь для трансфекции ДНК по каплям в чашку. Затем инкубируйте образцы в течение 8-24 часов.
Подготовьте буфер для лизиса клеток и буфер для дополнительного лизиса клеток, как указано в текстовом протоколе. Затем дважды промойте клетки ледяным PBS. Аспирируйте PBS и добавьте 1 миллилитр ледяного буфера для лизиса клеток.
Далее поставьте блюдо на лед, и выдержите в течение пяти минут. Затем с помощью скребка для клеток удалите клетки и перенесите их в охлаждаемую микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирку при 18 000-кратном давлении в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Затем переложите прозрачную надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку.
Постирайте соответствующий объем агарозных бусин в 1 миллилитре PBS. Затем центрифугируйте шарики при 300-кратном давлении и осторожно удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте в каждый образец по 20 микролитров шариков агарозы, и инкубируйте при температуре 4 градуса Цельсия в течение двух часов при вращении встык.
Центрифугируйте шарики при 300-кратной плотности и промойте их в буфере для лизиса клеток три раза. Затем повторно суспендируйте промытые шарики в 50 микролитрах разбавленного образца буфера. Наконец, нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия в течение двух-трех минут.
Обзор
В данной статье описывается метод детектирования и выделения специфических взаимодействующих белков с помощью аффинной очистки на основе бимолекулярной комплементации. Метод заключается в трансфекции клеток млекопитающих плазмидами, кодирующими белки-приманки и белки-мишени, слитые с комплементарными фрагментами флуоресцентного белка.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Белковые взаимодействия
Теоретическая часть
- Бимолекулярная флуоресцентная комплементация позволяет визуализировать взаимодействия белков.
- Фрагменты флуоресцентных белков могут быть использованы для подтверждения взаимодействий между белками.
- Данный метод применим в различных контекстах биологических исследований.
- Понимание взаимодействий белков имеет решающее значение для выяснения клеточных механизмов.
Цель исследования
- Изолировать и визуализировать специфические белковые взаимодействия в клетках млекопитающих.
- Продемонстрировать эффективность бимолекулярной комплементации в изучении динамики белков.
- Предоставить подробный протокол для воспроизведения данного метода исследователями.
Используемые методы
- Трансфекция клеток млекопитающих плазмидами для бимолекулярной флуоресцентной комплементации.
- Использование агента для трансфекции для облегчения поглощения плазмид.
- Лизис клеток и центрифугирование для выделения химерных белков.
- Вестерн-блоттинг для обнаружения взаимодействующих белков, меченных флуоресцентными фрагментами.
Основные результаты
- Успешная экспрессия фрагментов флуоресцентного белка в трансфицированных клетках.
- Подтверждение изоляции взаимодействующих белков с помощью вестерн-блоттинга.
- Визуализация белковых взаимодействий с использованием флуоресцентной микроскопии.
- Воспроизводимость протокола, подтвержденная в ходе нескольких серий опытов.
Выводы
- Бимолекулярная комплементация является эффективным методом изучения белковых взаимодействий.
- Данный метод может быть адаптирован для различных исследовательских целей в клеточной биологии.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для изучения сложных белковых сетей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метод BiCAP позволяет осуществлять прямую изоляцию специфических белковых димеров из лизатов клеток млекопитающих, обеспечивая функциональный анализ бинарных взаимодействий, что способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска. Сочетая бимолекулярную флуоресцентную комплементацию с аффинной очисткой, данный метод позволяет получать количественно определяемые комплексы для последующего анализа, снижая количество ложноположительных результатов при скрининге взаимодействий. Такой подход повышает достоверность прогнозов при выборе мишени за счет подтверждения физической ассоциации в условиях, близких к нативным.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изоляции специфических белковых пар «приманка-мишень» из сложных лизатов.
- Практическая ценность: обеспечивает биохимическое подтверждение взаимодействия, которое дополняет результаты методов визуализации.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе мишени за счет подтверждения физического взаимодействия перед проведением функциональных анализов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать изолированные белковые комплексы, подходящие для количественного вестерн-блоттинга или масс-спектрометрического анализа.
- Практическая ценность: используется стандартизированный метод осаждения (pulldown) на агарозных гранулах с применением конформационно-специфических нанотел для воспроизводимого захвата.
- Готовность анализа: полученный результат совместим с SDS-PAGE и иммуноблоттингом, что позволяет проводить масштабируемое профилирование взаимодействий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: изолированные комплексы могут быть проанализированы на предмет посттрансляционных модификаций или привлечения кофакторов, имеющих значение для патологических состояний.
- Снижение механистических рисков: подтверждает бинарное взаимодействие в определенной системе, что уменьшает неопределенность при картировании путей.
- Доклиническая значимость: совместимо с моделями клеток млекопитающих, используемыми в каскадах валидации мишеней и оптимизации соединений-лидеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод BiCAP занимает промежуточное положение между первичным скринингом взаимодействий и идентификацией ведущих соединений, обеспечивая этап биохимической валидации, который связывает методы визуализации и протеомного анализа.
- Открытия в биологии: Проверка гипотез о бинарных взаимодействиях путем выделения только тех пар белков, которые вызывают флуоресцентную комплементацию.
- Скрининг: Получение комплексов из лизата, пригодных для количественного определения, что способствует подтверждению хитов при скрининге взаимодействий.
- Аналитика: Возможность количественной оценки выделенных белков-приманок (bait) и белков-мишеней (prey) с помощью вестерн-блоттинга, что обеспечивает полуколичественную метрику взаимодействия.
- Трансляционные исследования: Выделенные комплексы могут быть исследованы на наличие модификаций, имеющих значение для заболевания, при использовании патогенных клеток или клеток-моделей заболевания.
- Корпоративное повторное использование: Плазмидные и нанотельные реагенты адаптируемы для различных пар белков, что позволяет использовать данный подход как платформу для валидации взаимодействий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет выделения только взаимодействующих флуоресцентно-комплементированных комплексов.
- Операционная ценность: Использует стандартизированные этапы лизиса, связывания и элюции, совместимые с существующей инфраструктурой аффинной очистки.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении исследований («go/no-go»), предоставляя биохимические доказательства взаимодействия, что снижает риск работы с ложноположительными мишенями.
- Влияние на портфель: Позволяет приоритизировать мишени с подтвержденным физическим взаимодействием, повышая эффективность каскадов идентификации перспективных соединений.
Особенности реализации
- Требуются навыки молекулярного клонирования для создания слитых конструкций «приманка» (bait) и «добыча» (prey) с совместимыми флуоресцентными фрагментами.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии для первичного подтверждения взаимодействия перед проведением очистки.
- Требуется стандартизация эффективности трансфекции и уровней экспрессии векторов «приманки» и «добычи» для обеспечения количественной сопоставимости.
- Адаптация к альтернативным модельным системам может потребовать оптимизации условий лизиса и проверки совместимости связывания нанотел.
- Практическое ограничение: метод выявляет только те взаимодействия, которые индуцируют правильный фолдинг и комплементацию фрагментов флуоресцентного белка.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование
Похожие видео
0 Просмотры
Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков
Похожие видео
0 Просмотры
Идентификация фосфата инозитола или фосфонинозидных взаимодействующих белков по хроматографии Affinity в сочетании с Западной погреловой или масс-спектрометрией
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии
Похожие видео
0 Просмотры
Бимолекулярные флуоресценции комплементации
Похожие видео
0 Просмотры
Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки
Похожие видео
0 Просмотры
Определение белковых комплексов в
Похожие видео
0 Просмотры
Тандемный аффинный анализ очистки для изучения белок-белковых взаимодействий
Похожие видео
0 Просмотры
MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL
Похожие видео
0 Просмотры
Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026