Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подавить экспрессию генов-мишеней в DCS путем трансфекции SI РНК. Это достигается путем программирования эффектора AM Maxin Nucleo. Вторым этапом процедуры является смешивание DCS и миРНК вместе и пипетирование полученного клеточного раствора в модули Nucleo QVE.

Третьим этапом процедуры является помещение тарелки в лоток для челноков amaxa, чтобы начать процесс трансфекции. Заключительным этапом процедуры является заражение клеток вирусом для активации интерферонового ответа. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают нокдаун гена с помощью количественного R-T-P-C-R и вестерн-блоттинга.

Этот метод ценен для характеристики сигнальных путей в дендретических клетках и может способствовать развитию иммунной терапии на основе дендретических клеток. Чтобы запрограммировать челночный нуклеофактор Maxon 96 для трансфекции постоянного тока, откройте новый файл параметров. Выберите количество лунок, которые вы будете использовать для стандартной трансфекции, наведя курсор на диаграмму пластин из 96 лунок.

Используйте как минимум три лунки для бассейна для каждой экспериментальной пробы. Теперь введите код программы в часть первую, выберите F, F и i часть вторую, выберите 1 68 из выпадающих меню. Затем в окне решения выберите моноцитарный человеческий следующий вариант под контролем, выберите стандартный, а затем нажмите «Применить».

Чтобы включить контроль без трансфекции, необходимо выбрать дополнительные скважины из диаграммы. Затем в опции управления выберите «Нет программного управления» и нажмите «Применить» еще раз. Смешав раствор для поражения ядер, дайте ему нагреться до комнатной температуры.

Поместите необходимое количество модулей nucleo vete в пластину nucleo VETE в правильной ориентации, как показано здесь, вставив первый из них в розу один и два, а затем так далее для всех последующих пробирок. Перенесите достаточное количество DCS из колбы для клеточных культур в 50-миллилитровую пробирку, чтобы получить 500 000 клеток в лунке для трансфекции, центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 400 G при четырех градусах Цельсия, а затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте в трубку раствор ядерного поражения, а затем снова суспендируйте DCS, осторожно пипетируя вверх и вниз несколько раз.

Теперь пометьте пробирки DPH в соответствии с конкретным лечением, которое должно быть выполнено, а затем разделите ресуспендированные клетки на помеченные пробирки. Добавьте SI РНК в конечной концентрации 0,25 мкг на 500 000 клеток в соответствующие эпиэндорфные трубки, а затем смешайте клеточные суспензии с помощью пипетирования. Используйте нецелевую РНК SI для контрольного образца без трансфекции.

Затем пипетку 20 мкл суспензии клеток SI RA DC в модули nucleo vete по заранее запрограммированной экспериментальной схеме, следя за тем, чтобы жидкость подавалась на дно лунки, накрыть пластину nucleo vete крышкой и несколько раз постучать пластиной по твердой поверхности, чтобы облегчить удаление пузырьков воздуха для трансфекции DCS. Вставьте подготовленное ядро Иветта в нуклеоэффектор 96 лунки челночного лотка. Затем нажмите кнопку «Загрузить и начать».

Следите за ходом процесса переливания на дисплее. Черный крест на зеленом фоне означает успешную трансфекцию в этом колодце, в то время как черная полоса на красном фоне означает, что она не увенчалась успехом во время трансфекции клеток. Предварительно подогрейте питательную среду DC по завершении процесса трансфекции, снимите пластину и добавьте по 80 микролитров предварительно теплой питательной среды DC в каждую лунку.

С помощью многоканальной пипетки теперь инкубируйте планшет в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. В течение инкубационного периода добавьте 100 микролитров предварительно теплой питательной среды DC в матричные пробирки в той же ориентации, что и установленная кюветная пластина для ядра. После инкубационного периода переложите все 100 микролитров клеточных суспензий из ядер CVE в заранее подготовленные матричные пробирки.

Затем извлеките и выбросьте те трубки, где не происходила трансфекция. Наконец, инкубируйте матричные пробирки в течение 24 часов или другого желаемого интервала времени. Пробирки Эйнора должны быть помечены для каждой из пробирок с инкубирующей матрицей.

Затем перенесите матричные пробирки из инкубатора в колпак для клеточных культур и объедините матричные пробирки для каждого экспериментального образца в предварительно помеченные eend dfs. Затем аккуратно гранулируйте клетки, вращая пробирки с концом DPH в настольной центрифуге в течение 10 минут. При 400 G удалите snat для ресуспендирования клеток в сыворотке свободной питательной среды, содержащей вирус болезни Ньюкасла или NDV при MOI равном одному.

Накройте эпи-эндорфины стерильным способом, а затем инкубируйте пробирки в течение 45 минут. После этого инкубационного периода добавьте 900 микролитров питательной среды DC и повторно инкубируйте пробирки еще на восемь-10 часов. Для сбора урожая трансфицированные и зараженные ДК.

Гранулирование клеток путем вращения эйноровых пробирок в настольной центрифуге, как и раньше, и удаление моноцитов snat: DCS были трансфицированы либо IRNA, нацеленной на RIG I, либо неспецифической светящейся ирнкой и инфицированы NDV, что обозначено знаком плюс, или остались неинфицированными, как указано знаком минус, как обнаружено количественным нокдауном R-T-P-C-R-A на 75%. На уровне транскрипции наблюдалось аналогичное снижение экспрессии интерферон бета. Также наблюдался нисходящий эффектор РГА в каскаде передачи сигналов интерферона. Кроме того, экспрессия интерферона бета в неинфицированных контрольных трансфицированных клетках не была обнаружена.

В то время как у МХА и интерферона бета нисходящий ответ гена был минимальным. Здесь. В данном эксперименте представлены данные второй трансфекции ДКБ с нацеливанием на ирнку риги, выполненной, как показано на предыдущем рисунке. Тем не менее, все клетки инфицированы NDV, и был включен дополнительный контроль с использованием нерезецированного моноцитарного DCS.

Результаты сайленсинга генов были аналогичны тем, которые наблюдались на предыдущем рисунке. Вестерн-блоттинг, исследованный на RGA, показал, что экспрессия белка этого гена была полностью заблокирована. Первая и вторая полосы показывают данные по лизатам из нерезецированных клеток.

На третьей и четвертой полосах показаны лизаты из клеток, трансфицированных светящимися ирнками, а на пятой и шестой полосах показаны лизаты из клеток, трансфицированных с помощью RIG I, нацеленного на S Irna После освоения этой техники, она может быть выполнена за один час, включая одновременное выбивание многих генов.