Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Общая цель данной процедуры заключается в подавлении экспрессии целевого гена в DCS с помощью трансфекции siRNA. Это достигается сначала путем программирования эффектора AM Maxin Nucleo. Вторым этапом процедуры является смешивание DCS и siRNA с последующим переносом полученного клеточного раствора в модули Nucleo QVE с помощью пипетки.

Третьим этапом процедуры является помещение планшета в лоток челнока Amaxa для начала процесса трансфекции. Заключительным этапом процедуры является инфицирование клеток вирусом для активации интерферонового ответа. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие нокдаун гена с помощью количественной R-T-P-C-R и вестерн-блоттинга.

Данный метод представляет ценность для характеристики сигнальных путей в дендритных клетках и может способствовать разработке иммунотерапии на основе дендритных клеток. Чтобы запрограммировать систему перемещения Maxon для трансфекции DC в 96-луночном планшете, откройте новый файл параметров. Выберите количество лунок, которые будут использоваться для стандартной трансфекции, переместив курсор по диаграмме 96-луночного планшета.

Для каждого экспериментального образца используйте как минимум три лунки для объединения. Теперь введите код программы: в первой части выберите F, F, а во второй части выберите 1 68 из выпадающих меню. Затем в окне выбора раствора выберите monocyte human, далее в опциях контроля выберите standard и нажмите кнопку apply.

Для включения контроля без трансфекции необходимо выбрать дополнительные лунки на схеме. Затем в меню опций контроля выберите «контроль без программы» и снова нажмите кнопку «применить». После перемешивания раствора для нуклеофекции дайте ему нагреться до комнатной температуры.

Поместите необходимое количество модулей nucleo vete в планшет nucleo VETE в правильной ориентации, как показано здесь: вставьте первый модуль в лунки один и два, затем повторите процедуру для всех последующих пробирок. Перенесите из флакона для культивирования клеток в пробирку объемом 50 мл достаточное количество DCS, чтобы обеспечить наличие 500 000 клеток на лунку для трансфекции. Центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 400 G и температуре 4 °C, после чего осторожно удалите супернатант. Затем добавьте в пробирку раствор для нуклеофекции и ресуспендируйте DCS, осторожно пропипетировав содержимое несколько раз.

Теперь промаркируйте пробирки DPH в соответствии с конкретной процедурой обработки, после чего распределите ресуспендированные клетки по промаркированным пробиркам. Добавьте SI RNA до конечной концентрации 0,25 µg на 500 000 клеток в соответствующие пробирки epi endorf, затем перемешайте клеточные суспензии путем пипетирования. Для контрольного образца без трансфекции используйте нецелевую SI RNA.

Затем с помощью пипетки внесите по 20 µL суспензии клеток SI RA DC в модули NucleoVet в соответствии с предварительно запрограммированной схемой эксперимента, следя за тем, чтобы жидкость попала на дно лунки; накройте планшет NucleoVet крышкой и несколько раз осторожно постучите планшетом по твердой поверхности, чтобы облегчить удаление пузырьков воздуха перед трансфекцией DC. Вставьте подготовленный планшет NucleoVet в лоток-шаттл NucleoEffector на 96 лунок. Затем нажмите кнопку «Upload and Start» (Загрузить и запустить).

Следите за ходом процесса трансфекции на дисплее. Черный крест на зеленом фоне означает успешную трансфекцию в данной лунке, тогда как черная полоса на красном фоне указывает на неудачную трансфекцию в процессе обработки клеток. После завершения процесса трансфекции подогрейте ростовую среду DC, извлеките планшет и добавьте по 80 µL подогретой ростовой среды DC в каждую лунку.

С помощью многоканального дозатора инкубируйте планшет в течение 10 минут при 37 °C и 5% CO2. В период инкубации добавьте 100 µL предварительно нагретой ростовой среды DC в матричные пробирки в том же порядке, как они расположены на планшете с нуклео-кюветами. По истечении времени инкубации перенесите все 100 µL клеточных суспензий из нуклео-кювет в заранее подготовленные матричные пробирки.

Затем извлеките и утилизируйте те пробирки, в которых трансфекция не произошла. Наконец, инкубируйте пробирки с матрицей в течение 24 часов или другого выбранного интервала времени. Подготовьте маркированные пробирки einor для каждой из инкубируемых пробирок с матрицей.

Затем перенесите матричные пробирки из инкубатора в ламинарный шкаф для культивирования клеток и объедините содержимое пробирок для каждого экспериментального образца в предварительно маркированные пробирки eend dfs. Далее осторожно осадите клетки, центрифугируя пробирки eend DPH в настольной центрифуге в течение 10 минут при 400 G. Удалите snat и аккуратно ресуспендируйте клетки в безсывороточной ростовой среде, содержащей вирус болезни Ньюкасла (NDV) с MOI равным одному.

Стерильным способом закройте пробирки с эпи-эндорфинами, затем инкубируйте их в течение 45 минут. После этого периода инкубации добавьте 900 µL среды для роста DC и повторно инкубируйте пробирки еще от 8 до 10 часов, чтобы собрать трансфицированные и инфицированные DC.

Осадите клетки, центрифугируя пробирки в настольной центрифуге, как и раньше, и удалите супернатант. Моноцитарные дендритные клетки (DCs) были трансфецированы либо иРНК, нацеленной на RIG-I, либо неспецифической контрольной иРНК, и инфицированы NDV (отмечено знаком «плюс») или остались неинфицированными (отмечено знаком «минус»), что было определено с помощью количественной RT-PCR. Снижение экспрессии RIG-I на 75% на уровне транскрипции сопровождалось аналогичным снижением экспрессии интерферона бета. Также наблюдалось снижение экспрессии нижестоящего эффектора RIG-I в каскаде сигналинга интерферона. Кроме того, экспрессия интерферона бета в неинфицированных контрольных трансфецированных клетках не была обнаружена.

В то время как ответ гена MXA и нижестоящих генов ответа интерферона бета был минимальным. Здесь представлены данные второго этапа трансфекции DCS с помощью риги-таргетированной иРНК, проведенной аналогично предыдущему рисунку. Однако в данном эксперименте все клетки были инфицированы NDV, а также был включен дополнительный контроль с использованием нерезецированных моноцитов DCS.

Результаты сайленсинга генов были аналогичны тем, что наблюдались на предыдущем рисунке. Вестерн-блот-анализ на RGA показал, что экспрессия белка этого гена была полностью заблокирована. В дорожках один и два представлены данные для лизатов нерезецированных клеток.

Дорожки три и четыре содержат лизаты клеток, трансфицированных контрольной siRNA, а дорожки пять и шесть — лизаты клеток, трансфицированных siRNA, нацеленной на RIG I. После освоения данную методику можно выполнить за один час, включая одновременный нокдаун нескольких генов.