Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке дендритных клеток к визуализирующим исследованиям с использованием нанокристаллов Q-точки. Это достигается путем выделения клеток костного мозга из мурны, бедренных и большеберцовых костей. Затем создаются культуры клеток костного мозга для облегчения дифференцировки клеток в дендритные клетки в присутствии ГМ СМЖ.

Затем дендритные клетки извлекаются из клеточных культур костного мозга через восемь дней. Заключительным этапом процедуры является окрашивание клеток флуоресцентными нанокристаллами Q. В конечном счете, ярко окрашенные дендритные клетки можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество использования этой технологии по сравнению с другими методами, такими как использование дендритных ячеек GFP, заключается в том, что нанокристаллы Q dot сохраняют свою флуоресценцию даже после окрашивания органическими растворителями, такими как ацетон. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологов дендритных клеток, такие как миграционные свойства этих клеток при различных заболеваниях или в контексте различных заболеваний. Демонстрировать процедуру окрашивания будет Мария Али, аспирантка из моей лаборатории.

После жертвоприношения тщательно рассеките большеберцовую и бедренную кости у двух мышей, не обрезая концы костей. Затем с помощью папиросной бумаги очистите все прикрепленные ткани от костей, стараясь не сломать их. В капюшоне с биозащитой.

Наполните 35-миллиметровую чашку Петри 70% этанолом, а затем погрузите кости в этанол на 10 минут. После того, как кости будут стерилизованы, извлеките их из этанола и дайте им высохнуть на воздухе в течение пяти минут в новой чашке Петри. Теперь разрежьте бедренную кость посередине и большеберцовую кость за самый тонкий кончик.

Впитайте внутрь костей один миллилитр среды RPMI с помощью стерильного шприца. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и промойте ее два раза средой RPMI путем 10-минутного центрифугирования при 300-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в центрифуге с качающимся ротором ведра. После последнего промывки ресуспендируют клетки в двух миллилитрах лизиса КФК, буферизуют и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре с целью элиминации эритроцитов.

Далее добавьте 13 миллилитров RPMI плюс 10% FBS и промойте ячейки еще два раза в этой среде с теми же настройками центрифуги, что и раньше. Посчитайте ячейки и отрегулируйте концентрацию до двух умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр. С RPMI плюс 10% FBS добавьте рекомбинантную мышью G-M-C-S-F до конечной концентрации 20 нанограмм на миллилитр.

Затем добавьте 10 миллилитров этой суспензии в стерильную микробиологическую 10-сантиметровую чашку Петри и закваскуйте. Клеточная суспензия в углекислотном инкубаторе. Через три дня добавьте еще 10 миллилитров RPMI плюс 10% FBS с 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного мышиного G-M-C-S-F в каждую из подготовленных пластин.

Еще через три дня извлеките по 10 миллилитров клеточной суспензии из каждой чашки Петри, центрифугируйте клетки в тех же условиях и повторно суспендируйте гранулу в том же объеме RPMI плюс 10% FBS, что и получено из чашек Петри, и пополните ее новым рекомбинантным мышиным G-M-C-S-F. Наконец, верните клеточную суспензию в каждую исходную чашку Петри и культивируйте клетки в течение двух дополнительных дней в инкубаторе с углекислым газом. После восьми дней в культуре восстановите плавающие и слабо прилипшие клетки, промыв чашки Петри свежей средой.

Затем пометьте собранные клетки с помощью набора для мечения клеток Q tracker 6 55, строго следуя инструкциям производителя, чтобы пометить пять раз по 10 до шестой части DCS, полученных из костного мозга мышей, нанокристаллами Q в концентрации 10 наномоляров. Сначала смешайте по пять микролитров каждого из компонентов набора А и В в пробирке эйнора и выдержите смесь в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте один миллилитр RPMI плюс 10% FBS и закручивайте трубку в течение 30 секунд.

Далее прибавьте пять умножить на 10 к пятому. DCS суспендируют в 0,5 миллилитрах RPMI плюс 10% FBS в трубку эйнора и инкубируют клетки в растворе D при 37 градусах Цельсия в течение 60 минут. Затем промойте ячейки два раза в RPMI плюс 10% FBS в тех же условиях, что и раньше, и повторно суспендируйте гранулу в RPMI.

На этом рисунке показан пример флуоресцентной микрофотографии DCS. Сразу после маркировки капля меченых ячеек наносилась на предметное стекло и накрывалась покровным листом. Затем образцы оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.

На этом рисунке флуоресцентная микрофотография ДК через 48 часов можно увидеть меченое созревание in vitro. ДЦП культивировали в течение 48 часов с концентрацией 100 нанограмм на миллилитр, ЛПС и 20 нанограммов на миллилитр, ФНО альфа на камерах для культивирования предметного стекла в инкубаторе углекислого газа. Затем образцы промывали PBS, фиксированным ацетоном, окрашивали с помощью DPI и оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Меченые ДК, созревшие in vitro, были проанализированы методом проточной цитометрии: точкам Q окрашенные клетки дают сильный сигнал в ФЛ по трем каналам Q, окрашенные и неокрашенные. ДК дополнительно окрашивали специфическими антителами против маркеров созревания, CD 86 и CD 40, а клетки изотипа контролируют с помощью проточной цитометрии. Кроме того, определяли уровни IL6 и оксида азота в надосадочной жидкости зрелых DCS с Q-окрашиванием и в контроле.

Здесь репрезентативная фигура меченого DCS в рассеченной ткани показана меченой. Зрелые ДК были внутривенно введены черным шести мышам C 57. Три дня спустя мышей принесли в жертву, а селезенку собрали.

Мгновенную заморозку, встроенную в ОКТ, и срезы размером восемь микрон готовили с помощью криостата. Затем образцы были зафиксированы ацетоном, противоокрашены DPI и оценены с помощью флуоресцентного микроскопа. Выполнение этой процедуры.

Другие методы, такие как позирование антигена или созревание с различными стимулами, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как миграция дендритных клеток в ответ на различные стимулы созревания.