Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований
2 июня 2011 г.
Дендритные поглощение клетками антигены и мигрировать в органах иммунной системы в настоящее время обрабатываются антигенов Т-клеток. Qdot нанокристаллов маркировка обеспечивает длительную и стабильную флуоресцентный сигнал. Это позволяет отслеживать дендритных клеток в различных органах методом флуоресцентной микроскопии.
Общая цель этой процедуры заключается в подготовке дендритных клеток к визуализирующим исследованиям с использованием нанокристаллов Q-точки. Это достигается путем выделения клеток костного мозга из мурны, бедренных и большеберцовых костей. Затем создаются культуры клеток костного мозга для облегчения дифференцировки клеток в дендритные клетки в присутствии ГМ СМЖ.
Затем дендритные клетки извлекаются из клеточных культур костного мозга через восемь дней. Заключительным этапом процедуры является окрашивание клеток флуоресцентными нанокристаллами Q. В конечном счете, ярко окрашенные дендритные клетки можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основное преимущество использования этой технологии по сравнению с другими методами, такими как использование дендритных ячеек GFP, заключается в том, что нанокристаллы Q dot сохраняют свою флуоресценцию даже после окрашивания органическими растворителями, такими как ацетон. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологов дендритных клеток, такие как миграционные свойства этих клеток при различных заболеваниях или в контексте различных заболеваний. Демонстрировать процедуру окрашивания будет Мария Али, аспирантка из моей лаборатории.
После жертвоприношения тщательно рассеките большеберцовую и бедренную кости у двух мышей, не обрезая концы костей. Затем с помощью папиросной бумаги очистите все прикрепленные ткани от костей, стараясь не сломать их. В капюшоне с биозащитой.
Наполните 35-миллиметровую чашку Петри 70% этанолом, а затем погрузите кости в этанол на 10 минут. После того, как кости будут стерилизованы, извлеките их из этанола и дайте им высохнуть на воздухе в течение пяти минут в новой чашке Петри. Теперь разрежьте бедренную кость посередине и большеберцовую кость за самый тонкий кончик.
Впитайте внутрь костей один миллилитр среды RPMI с помощью стерильного шприца. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и промойте ее два раза средой RPMI путем 10-минутного центрифугирования при 300-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в центрифуге с качающимся ротором ведра. После последнего промывки ресуспендируют клетки в двух миллилитрах лизиса КФК, буферизуют и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре с целью элиминации эритроцитов.
Далее добавьте 13 миллилитров RPMI плюс 10% FBS и промойте ячейки еще два раза в этой среде с теми же настройками центрифуги, что и раньше. Посчитайте ячейки и отрегулируйте концентрацию до двух умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр. С RPMI плюс 10% FBS добавьте рекомбинантную мышью G-M-C-S-F до конечной концентрации 20 нанограмм на миллилитр.
Затем добавьте 10 миллилитров этой суспензии в стерильную микробиологическую 10-сантиметровую чашку Петри и закваскуйте. Клеточная суспензия в углекислотном инкубаторе. Через три дня добавьте еще 10 миллилитров RPMI плюс 10% FBS с 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного мышиного G-M-C-S-F в каждую из подготовленных пластин.
Еще через три дня извлеките по 10 миллилитров клеточной суспензии из каждой чашки Петри, центрифугируйте клетки в тех же условиях и повторно суспендируйте гранулу в том же объеме RPMI плюс 10% FBS, что и получено из чашек Петри, и пополните ее новым рекомбинантным мышиным G-M-C-S-F. Наконец, верните клеточную суспензию в каждую исходную чашку Петри и культивируйте клетки в течение двух дополнительных дней в инкубаторе с углекислым газом. После восьми дней в культуре восстановите плавающие и слабо прилипшие клетки, промыв чашки Петри свежей средой.
Затем пометьте собранные клетки с помощью набора для мечения клеток Q tracker 6 55, строго следуя инструкциям производителя, чтобы пометить пять раз по 10 до шестой части DCS, полученных из костного мозга мышей, нанокристаллами Q в концентрации 10 наномоляров. Сначала смешайте по пять микролитров каждого из компонентов набора А и В в пробирке эйнора и выдержите смесь в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте один миллилитр RPMI плюс 10% FBS и закручивайте трубку в течение 30 секунд.
Далее прибавьте пять умножить на 10 к пятому. DCS суспендируют в 0,5 миллилитрах RPMI плюс 10% FBS в трубку эйнора и инкубируют клетки в растворе D при 37 градусах Цельсия в течение 60 минут. Затем промойте ячейки два раза в RPMI плюс 10% FBS в тех же условиях, что и раньше, и повторно суспендируйте гранулу в RPMI.
На этом рисунке показан пример флуоресцентной микрофотографии DCS. Сразу после маркировки капля меченых ячеек наносилась на предметное стекло и накрывалась покровным листом. Затем образцы оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.
На этом рисунке флуоресцентная микрофотография ДК через 48 часов можно увидеть меченое созревание in vitro. ДЦП культивировали в течение 48 часов с концентрацией 100 нанограмм на миллилитр, ЛПС и 20 нанограммов на миллилитр, ФНО альфа на камерах для культивирования предметного стекла в инкубаторе углекислого газа. Затем образцы промывали PBS, фиксированным ацетоном, окрашивали с помощью DPI и оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Меченые ДК, созревшие in vitro, были проанализированы методом проточной цитометрии: точкам Q окрашенные клетки дают сильный сигнал в ФЛ по трем каналам Q, окрашенные и неокрашенные. ДК дополнительно окрашивали специфическими антителами против маркеров созревания, CD 86 и CD 40, а клетки изотипа контролируют с помощью проточной цитометрии. Кроме того, определяли уровни IL6 и оксида азота в надосадочной жидкости зрелых DCS с Q-окрашиванием и в контроле.
Здесь репрезентативная фигура меченого DCS в рассеченной ткани показана меченой. Зрелые ДК были внутривенно введены черным шести мышам C 57. Три дня спустя мышей принесли в жертву, а селезенку собрали.
Мгновенную заморозку, встроенную в ОКТ, и срезы размером восемь микрон готовили с помощью криостата. Затем образцы были зафиксированы ацетоном, противоокрашены DPI и оценены с помощью флуоресцентного микроскопа. Выполнение этой процедуры.
Другие методы, такие как позирование антигена или созревание с различными стимулами, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как миграция дендритных клеток в ответ на различные стимулы созревания.
Обзор
В данном исследовании описывается процедура подготовки дендритных клеток для визуализации с использованием нанокристаллов Qdot. Этот метод позволяет визуализировать дендритные клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, что дает возможность изучить особенности их миграции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретическая часть
- Дендритные клетки играют ключевую роль в иммунном ответе, представляя антигены Т-клеткам.
- Нанокристаллы Qdot обеспечивают стабильный флуоресцентный сигнал для отслеживания клеток.
- Данный метод расширяет возможности изучения поведения дендритных клеток при различных патологических состояниях.
- Традиционные методы могут не обеспечивать аналогичного уровня стабильности флуоресценции.
Цель исследования
- Разработать надежный метод маркировки дендритных клеток нанокристаллами Qdot.
- Обеспечить возможность отслеживания дендритных клеток in vivo.
- Изучить миграционные свойства дендритных клеток при различных моделях заболеваний.
Используемые методы
- Выделение клеток костного мозга мышей.
- Культивирование клеток с ГМ-КСФ для дифференцировки в дендритные клетки.
- Окрашивание дендритных клеток нанокристаллами Qdot.
- Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Основные результаты
- Успешно маркированные дендритные клетки демонстрировали сильные сигналы флуоресценции.
- Продемонстрирована стабильность нанокристаллов Qdot по сравнению с GFP-метками.
- Визуализированы процессы созревания и миграции дендритных клеток in vitro и in vivo.
- Получены новые данные о механизмах иммунного ответа с участием дендритных клеток.
Выводы
- Метод маркировки квантовыми точками (Qdot) эффективен для изучения динамики дендритных клеток.
- Данный метод может углубить понимание поведения дендритных клеток при различных заболеваниях.
- В будущих исследованиях этот подход можно использовать для изучения различных стимулов созревания.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Маркировка дендритных клеток нанокристаллами Qdot обеспечивает стабильную долгосрочную флуоресценцию для отслеживания миграции иммунных клеток в доклинических моделях. Данный подход способствует снижению механистических рисков при разработке иммунотерапии, обеспечивая надежную визуализацию динамики антигенпрезентирующих клеток. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, позволяя напрямую наблюдать за поведением дендритных клеток в системах, релевантных данной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути миграции дендритных клеток и презентации антигена в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильную флуоресцентную метку, которая сохраняется после фиксации и воздействия растворителей, что снижает потерю сигнала при обработке тканей.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации биологических препаратов на основе дендритных клеток путем отслеживания их локализации in vivo и статуса созревания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели флуоресценции для оценки стадий созревания и активации дендритных клеток.
- Практическая ценность: совместим с платформами проточной цитометрии и микроскопии, что обеспечивает возможность высококонтентного скрининга иммуномодулирующих соединений.
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные партии меченых дендритных клеток, подходящие для воспроизводимых анализов иммунного профилирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает отслеживание миграции дендритных клеток из периферических тканей в лимфоидные органы, моделируя иммунный надзор.
- Практическая ценность: позволяет проводить лонгитюдные исследования визуализации на моделях мышей для оценки иммунных ответов, индуцированных вакцинами или адъювантами.
- Трансляционная значимость: способствует проведению исследований с использованием биомаркеров путем установления корреляции между локализацией дендритных клеток и функциональными иммунными результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочий процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени до доклинического иммунного профилирования, позволяя использовать визуализацию динамики дендритных клеток в качестве функционального показателя при иммуномодулирующем скрининге.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функциях дендритных клеток в процессах захвата антигена, миграции и праймирования Т-клеток.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированную подготовку меченных дендритных клеток для скрининга соединений и профилирования иммуномодуляторов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные флуоресцентного анализа и проточной цитометрии для сравнения созревания и активации дендритных клеток при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает поведение дендритных клеток in vitro с закономерностями их перемещения in vivo в соответствующих моделях заболеваний на мышах.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает универсальную платформу для мечения иммунных клеток, применимую в нескольких проектах по поиску средств иммунотерапии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность иммунных ответов, опосредованных дендритными клетками, за счет стабильного долгосрочного отслеживания.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость в различных лабораториях благодаря стандартизированному протоколу маркировки и минимальной вариативности между партиями.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки методов иммунотерапии, предоставляя прямые визуальные доказательства взаимодействия с мишенью и миграции иммунных клеток.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе валидированных профилей модуляции и миграции дендритных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток, влажными методами стерилизации и флуоресцентной микроскопией.
- Доступность метода зависит от наличия наборов для маркировки Qdot, проточных цитофлуориметров и криостата для изготовления срезов тканей.
- Необходима стандартизация времени дифференцировки клеток и концентрации меток для всех пользователей.
- Адаптация метода для моделей дендритных клеток человека может потребовать оптимизации условий применения цитокинов и эффективности маркировки.
- Практические ограничения включают возможную агрегацию Qdots при высоких концентрациях и необходимость тщательного титрования для предотвращения цитотоксичности.
