Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований
2 июня 2011 г.
Дендритные поглощение клетками антигены и мигрировать в органах иммунной системы в настоящее время обрабатываются антигенов Т-клеток. Qdot нанокристаллов маркировка обеспечивает длительную и стабильную флуоресцентный сигнал. Это позволяет отслеживать дендритных клеток в различных органах методом флуоресцентной микроскопии.
Общая цель данной процедуры заключается в подготовке дендритных клеток для визуализационных исследований с использованием нанокристаллов квантовых точек. Это достигается путем первоначального выделения клеток костного мозга из селезенки, бедренных и большеберцовых костей. Затем создаются культуры клеток костного мозга для обеспечения дифференцировки клеток в дендритные клетки в присутствии GM-CSF.
Затем, через восемь дней, дендритные клетки собирают из культур клеток костного мозга. Заключительным этапом процедуры является окрашивание клеток флуоресцентными нанокристаллами Q. В итоге ярко окрашенные дендритные клетки можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основным преимуществом использования данной технологии по сравнению с другими методами, такими как использование дендритных клеток с GFP-меткой, является то, что нанокристаллы квантовых точек сохраняют свою флуоресценцию даже после окрашивания с применением органических растворителей, например, ацетона. Данный метод поможет ответить на ключевые вопросы биологов, изучающих дендритные клетки, такие как свойства миграции этих клеток при различных заболеваниях или в контексте различных патологий. Процедуру окрашивания продемонстрирует Мария Али, аспирантка моей лаборатории.
После жертвования животных аккуратно выделите большеберцовые и бедренные кости двух мышей, стараясь не повредить концы костей. Затем с помощью бумажных салфеток очистите кости от всех прилегающих тканей, соблюдая осторожность, чтобы не сломать их. Все манипуляции проводите в боксе биологической безопасности.
Наполните чашку Петри диаметром 35 мм 70% ethanol, затем погрузите кости в ethanol на 10 минут. После стерилизации извлеките кости из ethanol и оставьте их высыхать на воздухе в течение пяти минут в новой чашке Петри. Затем разрежьте бедренную кость посередине, а большеберцовую кость — в области ее самого тонкого конца.
С помощью стерильного шприца введите один миллилитр среды RPMI внутрь костей. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и промойте ее дважды средой RPMI путем центрифугирования в течение 10 минут при 300 ×g и температуре четырех градусов Celsius в центрифуге с ротором с поворотными стаканами. После последнего промывания ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах лизирующего буфера CK и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре для удаления эритроцитов.
Затем добавьте 13 мл RPMI с 10% FBS и промойте клетки в этой среде еще дважды, используя те же настройки центрифугирования, что и раньше. Подсчитайте количество клеток и доведите концентрацию до 2 × 10⁵ клеток на мл. В среду RPMI с 10% FBS добавьте рекомбинантный murine G-M-C-S-F до конечной концентрации 20 нг/мл.
Затем добавьте 10 миллилитров этой суспензии в стерильную чашку Петри диаметром 10 сантиметров микробиологического качества и культивируйте суспензию клеток в инкубаторе с углекислым газом. Через три дня добавьте в каждую из подготовленных чашек еще 10 миллилитров среды RPMI с 10% FBS и 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного G-M-C-S-F мыши.
Спустя еще три дня возьмите по 10 мл клеточной суспензии из каждой чашки Петри, центрифугируйте клетки в тех же условиях и ресуспендируйте осадок в том же объеме среды RPMI с 10% FBS, который был извлечен из чашек Петри, добавив новый рекомбинантный G-M-C-S-F мыши. Наконец, верните клеточную суспензию в исходные чашки Петри и культивируйте клетки еще два дня в инкубаторе с углекислым газом. После восьми дней культивирования соберите плавающие и слабо прикрепленные клетки, промыв чашки Петри свежей средой.
Затем проведите маркировку собранных клеток с помощью набора для маркировки клеток Q tracker 6 55, строго следуя инструкциям производителя, чтобы пометить 5 × 10⁶ дендритных клеток (DCs), полученных из костного мозга мыши, Q-нанокристаллами в концентрации 10 nM. Сначала смешайте по 5 µL каждого из компонентов набора A и B в пробирке типа «Эппендорф» и инкубируйте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 1 мл среды RPMI с 10% FBS и перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 30 секунд.
Затем добавьте 5 × 10⁵ клеток, суспендированных в 0,5 мл RPMI с 10% FBS, в пробирку Eppendorf и инкубируйте клетки в растворе D при 37 °C в течение 60 минут. Затем дважды промойте клетки в RPMI с 10% FBS в тех же условиях, что и ранее, и ресуспендируйте осадок в RPMI.
На этом рисунке представлен пример флуоресцентной микрофотографии dcs. Сразу после маркировки каплю маркированных клеток наносили на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Затем образцы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
На данном рисунке представлена подписанная флуоресцентная микрофотография дендритных клеток (ДК) после 48 часов созревания in vitro. ДК культивировали в течение 48 часов в камерах для культивирования на предметных стеклах в CO2-инкубаторе с добавлением LPS в концентрации 100 нг/мл и TNF-α в концентрации 20 нг/мл. Затем образцы промывали раствором PBS, фиксировали ацетоном, окрашивали контрастным красителем DPI и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Маркированные дКС, подвергнутые созреванию in vitro, анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки, окрашенные квантовыми точками (Q dot), давали сильный сигнал в канале FL3 (окрашенные квантовыми точками и неокрашенные). Кроме того, дКС окрашивали специфическими антителами к маркерам созревания CD86 и CD40, а также изотипическими контролями, после чего проводили анализ методом проточной цитометрии. Дополнительно определяли уровни IL6 и оксида азота в супернатантах зрелых дКС, окрашенных квантовыми точками, и контрольных образцов.
Здесь представлено типичное изображение меченных DCS в препарированной ткани. Зрелые DCS вводили внутривенно мышам линии C 57 black six. Через три дня мышей усыпили и извлекли селезенки.
Образцы подвергли мгновенной заморозке в среде OCT, затем с помощью криостата подготовили срезы толщиной 8 мкм. Образцы фиксировали ацетоном, докрашивали DPI и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, следуя данным процедурам.
Для поиска ответов на дополнительные вопросы, такие как миграция дендритных клеток в ответ на различные стимулы созревания, могут быть применены другие методы, например, воздействие антигена или созревание с использованием различных стимуляторов.
Обзор
В данном исследовании описывается процедура подготовки дендритных клеток для визуализации с использованием нанокристаллов Qdot. Этот метод позволяет визуализировать дендритные клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, что дает возможность изучить особенности их миграции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретическая часть
- Дендритные клетки играют ключевую роль в иммунном ответе, представляя антигены Т-клеткам.
- Нанокристаллы Qdot обеспечивают стабильный флуоресцентный сигнал для отслеживания клеток.
- Данный метод расширяет возможности изучения поведения дендритных клеток при различных патологических состояниях.
- Традиционные методы могут не обеспечивать аналогичного уровня стабильности флуоресценции.
Цель исследования
- Разработать надежный метод маркировки дендритных клеток нанокристаллами Qdot.
- Обеспечить возможность отслеживания дендритных клеток in vivo.
- Изучить миграционные свойства дендритных клеток при различных моделях заболеваний.
Используемые методы
- Выделение клеток костного мозга мышей.
- Культивирование клеток с ГМ-КСФ для дифференцировки в дендритные клетки.
- Окрашивание дендритных клеток нанокристаллами Qdot.
- Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Основные результаты
- Успешно маркированные дендритные клетки демонстрировали сильные сигналы флуоресценции.
- Продемонстрирована стабильность нанокристаллов Qdot по сравнению с GFP-метками.
- Визуализированы процессы созревания и миграции дендритных клеток in vitro и in vivo.
- Получены новые данные о механизмах иммунного ответа с участием дендритных клеток.
Выводы
- Метод маркировки квантовыми точками (Qdot) эффективен для изучения динамики дендритных клеток.
- Данный метод может углубить понимание поведения дендритных клеток при различных заболеваниях.
- В будущих исследованиях этот подход можно использовать для изучения различных стимулов созревания.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Маркировка дендритных клеток нанокристаллами Qdot обеспечивает стабильную долгосрочную флуоресценцию для отслеживания миграции иммунных клеток в доклинических моделях. Данный подход способствует снижению механистических рисков при разработке иммунотерапии, обеспечивая надежную визуализацию динамики антигенпрезентирующих клеток. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, позволяя напрямую наблюдать за поведением дендритных клеток в системах, релевантных данной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути миграции дендритных клеток и презентации антигена в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильную флуоресцентную метку, которая сохраняется после фиксации и воздействия растворителей, что снижает потерю сигнала при обработке тканей.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации биологических препаратов на основе дендритных клеток путем отслеживания их локализации in vivo и статуса созревания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели флуоресценции для оценки стадий созревания и активации дендритных клеток.
- Практическая ценность: совместим с платформами проточной цитометрии и микроскопии, что обеспечивает возможность высококонтентного скрининга иммуномодулирующих соединений.
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные партии меченых дендритных клеток, подходящие для воспроизводимых анализов иммунного профилирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает отслеживание миграции дендритных клеток из периферических тканей в лимфоидные органы, моделируя иммунный надзор.
- Практическая ценность: позволяет проводить лонгитюдные исследования визуализации на моделях мышей для оценки иммунных ответов, индуцированных вакцинами или адъювантами.
- Трансляционная значимость: способствует проведению исследований с использованием биомаркеров путем установления корреляции между локализацией дендритных клеток и функциональными иммунными результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочий процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени до доклинического иммунного профилирования, позволяя использовать визуализацию динамики дендритных клеток в качестве функционального показателя при иммуномодулирующем скрининге.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функциях дендритных клеток в процессах захвата антигена, миграции и праймирования Т-клеток.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированную подготовку меченных дендритных клеток для скрининга соединений и профилирования иммуномодуляторов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные флуоресцентного анализа и проточной цитометрии для сравнения созревания и активации дендритных клеток при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает поведение дендритных клеток in vitro с закономерностями их перемещения in vivo в соответствующих моделях заболеваний на мышах.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает универсальную платформу для мечения иммунных клеток, применимую в нескольких проектах по поиску средств иммунотерапии.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность иммунных ответов, опосредованных дендритными клетками, за счет стабильного долгосрочного отслеживания.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость в различных лабораториях благодаря стандартизированному протоколу маркировки и минимальной вариативности между партиями.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки методов иммунотерапии, предоставляя прямые визуальные доказательства взаимодействия с мишенью и миграции иммунных клеток.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе валидированных профилей модуляции и миграции дендритных клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток, влажными методами стерилизации и флуоресцентной микроскопией.
- Доступность метода зависит от наличия наборов для маркировки Qdot, проточных цитофлуориметров и криостата для изготовления срезов тканей.
- Необходима стандартизация времени дифференцировки клеток и концентрации меток для всех пользователей.
- Адаптация метода для моделей дендритных клеток человека может потребовать оптимизации условий применения цитокинов и эффективности маркировки.
- Практические ограничения включают возможную агрегацию Qdots при высоких концентрациях и необходимость тщательного титрования для предотвращения цитотоксичности.
