TALEN-опосредованная интеграция целевых генов: использование сконструированных последовательно-специфичных нуклеаз для точной вставки гена флуоресцентного белка в гиПСК
Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 4:24 мин. • July 8th, 2025
Начните с индуцированной человеком плюрипотентной стволовой клетки или суспензии ИПСК в среде. Добавьте пару активатороподобных эффекторных нуклеаз транскрипции или плазмид, кодирующих TALEN. Дополните донорской плазмидой, несущей ген флуоресцентного белка, соединенный с геном устойчивости к антибиотикам, с соседними гомологическими плечами для специфического выравнивания по локусам-мишеням.
Электропорируйте смесь для образования переходных пор в клеточных мембранах, что обеспечивает интернализацию плазмид. Попадая внутрь клеток, плазмиды, кодирующие TALEN, обрабатываются, производя TALEN - химерные белки, состоящие из сайт-специфичного ДНК-связывающего домена TALE, слитого с неспецифическим доменом расщепления эндонуклеазы рестрикции FokI.
Каждый мономер TALEN через свой ДНК-связывающий домен, состоящий из тандемных модулей повторов аминокислот, распознает и связывается с локусами-мишенями, по одному модулю на нуклеотид, на каждой цепи ДНК в противоположных ориентациях, разделенных спейсерной последовательностью. Затем домены FokI димеризуются и расщепляют ДНК в последовательности спейсера, создавая двухцепочечные разрывы с выступами.
В присутствии донорской плазмиды, содержащей г
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео