TALEN-опосредованная интеграция целевых генов: использование сконструированных последовательно-специфичных нуклеаз для точной вставки гена флуоресцентного белка в гиПСК

Начните с индуцированной человеком плюрипотентной стволовой клетки или суспензии ИПСК в среде. Добавьте пару активатороподобных эффекторных нуклеаз транскрипции или плазмид, кодирующих TALEN. Дополните донорской плазмидой, несущей ген флуоресцентного белка, соединенный с геном устойчивости к антибиотикам, с соседними гомологическими плечами для специфического выравнивания по локусам-мишеням.

Электропорируйте смесь для образования переходных пор в клеточных мембранах, что обеспечивает интернализацию плазмид. Попадая внутрь клеток, плазмиды, кодирующие TALEN, обрабатываются, производя TALEN - химерные белки, состоящие из сайт-специфичного ДНК-связывающего домена TALE, слитого с неспецифическим доменом расщепления эндонуклеазы рестрикции FokI.

Каждый мономер TALEN через свой ДНК-связывающий домен, состоящий из тандемных модулей повторов аминокислот, распознает и связывается с локусами-мишенями, по одному модулю на нуклеотид, на каждой цепи ДНК в противоположных ориентациях, разделенных спейсерной последовательностью. Затем домены FokI димеризуются и расщепляют ДНК в последовательности спейсера, создавая двухцепочечные разрывы с выступами.

В присутствии донорской плазмиды, содержащей гомологические плечи, комплементарные областям, фланкирующим расщепленный сайт, происходит гомологическая репарация с использованием гомологичной последовательности в качестве матрицы для синтеза репарации ДНК для моста двухцепочечных разрывов. После лигирования зазубрин промежуточный флуоресцентный белок и гены устойчивости к антибиотикам интегрируются в геном хозяина.

Обрабатывайте ИПСК с посевом на слое питающих клеток для поддержки роста с помощью антибиотических сред. Ген устойчивости к антибиотикам без промотора, приводимый в действие вышестоящим эндогенным промотором, облегчает отбор клеток, отредактированных TALEN.

Начните с однократной промывки культур iPSC PBS, затем добавьте 1 миллилитр реагента для мягкой диссоциации клеток 37 градусов Цельсия в каждую лунку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 5 минут. Когда более 50% клеток диссоциируют от питательного сосуда, используйте пипетку P1000 для механического разрушения любых оставшихся клеточных скоплений или прикрепленных клеток. Затем добавьте по 2 миллилитра среды Е8 в каждую лунку, и с помощью 10-миллилитровой пипетки дополнительно разложите культуры на одноклеточные суспензии.

Теперь вылейте собранные клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку и закрутите их вниз. Повторно суспендируйте гранулу в минимальном количестве среды E8 для подсчета. Затем, после подтверждения жизнеспособности культур путем исключения трипанового синего, а также их достаточной диссоциации, переносят по 3 млн клеток в каждую из двух 15-миллилитровых конических пробирок.

Пока клетки центрифугируются, настройте систему электропорации на программу, специфичную для клеточного типа линии эмбриональных стволовых клеток человека, H9. Затем добавьте 10 мкг только гомологичного рекомбинационного донора к 1 грануле для контрольного образца и 10 мкг гомологичной рекомбинационной донорской плазмиды вместе с 5 мкг каждой плазмиды TALEN для экспериментального образца.

Затем добавьте 100 микролитров полного раствора для трансфекции первичных клеток P3 комнатной температуры в каждую из контрольных и экспериментальных гранул и повторно суспендируйте клетки. Перенесите образцы в отдельные кюветы, а затем электропорируйте образцы. Сразу после трансфекции добавьте в каждую кювету 500 микролитров среды Е8 комнатной температуры, а затем переложите пересеченные образцы ИПСК по каплям в отдельные 10-сантиметровые чашки, содержащие эмбриональные фибробласты мыши DR4.