Асептики лаборатории: Покрытие методы

[Рассказчик] Этот протокол включает в себя асептическую технику в методах гальванического покрытия, используемых для выделения, размножения или перечисления микроорганизмов, таких как бактерии и фаги. Процедуры включают в себя полосатое покрытие бактериальных культур для выделения отдельных колоний. Залить гальваническое покрытие для определения концентрации бактерий. И распространить покрытие для перечисления жизнеспособных колоний бактерий. Мягкие агаровые накладки используются для выделения фагов и перечисления бляшек, в то время как репликация покрытия переносит клетки с одной пластины на другую по идентичной пространственной схеме. В конечном счете, практическое применение этих методов для культивирования микроорганизмов варьируется от идентификации бактерий в окружающей среде до технологических достижений в молекулярной генетике и высокопроизводительных биотестов.

- Как правило, люди, плохо знакомые с этими методами гальванического покрытия, могут испытывать трудности, поскольку манипуляции требуют осторожных и скоординированных движений, избегающих контакта с нестерильными поверхностями. Изучение этих рутинных процедур требует обучения и практики. Демонстрировать процедуры будет координатор моей лаборатории, доктор Крис Редди.

- [Рассказчик] Начните работу с микроорганизмами, зная лабораторные правила и меры предосторожности, включая классификацию биологической опасности, обеззараживание отходов и утилизацию. Убедитесь, что все инструменты, растворы и носители для процедур нанесения покрытий стерильны. Также создайте чистое рабочее пространство. Очистите его дезинфицирующим средством. Установите горелку Бунзена с трубкой, подключенной к газовой магистрали, расставьте необходимые запасы материалов с соответствующей маркировкой. Приступайте к тщательному мытью рук с антисептическим мылом и теплой водой. Сначала намочите руки теплой проточной водой, затем нанесите и тщательно распределите мыло. Энергично потрите руки, создавая трение на всех поверхностях, включая большие пальцы, тыльную сторону пальцев, тыльную сторону ладоней и под ногтями. Затем тщательно смойте, чтобы удалить остатки мыла, и высушите с помощью бумажных полотенец, выданных из держателя. Наконец, свежим бумажным полотенцем перекройте кран. Процедура Streak Plate предназначена для выделения чистых культур бактерий или колоний из смешанных популяций путем простого механического разделения. Выньте агаровую пластину из холодной камеры с температурой четыре градуса Цельсия и предварительно нагрейте до комнатной температуры. Выберите инструмент из массива инструментов для полосатости пластины. Убедитесь, что тарелка сухая, без конденсата на крышке. Нанесите маркировку на нижнюю часть агаровой пластины по краю. Если у вас есть опыт, используйте одну пластину для нескольких образцов. Затем зажгите горелку Бунзена, чтобы разжечь металлическую петлю. Начните в трех-четырех дюймах от металлической петли с проволокой на кончике синего конуса, самой горячей части пламени горелки Бунзена. Когда металл раскалится докрасна, переместите проволоку так, чтобы пламя приблизилось к петле. Чтобы охладить петлю, коснитесь края агаровой среды, издающей шипящий звук. Продолжайте набирать инокулюм по петле. Поднимите нижнюю половину тарелки. Перемещайте петлю вперед и назад от обода к центру в первом квадранте пластины. Опустите перевернутую тарелку обратно на крышку. Повторно разожгите металлическую петлю. Поверните чашку Петри на 90 градусов. Коснитесь петли ближе к концу последней полосы, используя схему «туда-сюда», пересеките последнюю половину полос в первом квадранте, затем перейдите в пустой второй квадрант. Как только второй квадрант будет заполнен, поставьте тарелку. Повторите процедуру нанесения полос для третьего и четвертого квадрантов, избегая контакта с первым квадрантом. Для полос стерильной плоской зубочисткой аккуратно держите узкий конец между большим и безымянным пальцами под углом от 10 до 20 градусов к средней, используйте широкий конец для полос по квадрантам. Переверните пластину обратно на крышку между квадрантами и утилизируйте зубочистку соответствующим образом. Приступайте к инкубации пластин с прожилками вверх дном. Процедура заливки пластин перечисляет общее количество колониеобразующих единиц на поверхности и внутри агара одной пластины. Установите таймер на 10 минут, затем перенесите 18 миллилитров расплавленной агаровой среды с водяной бани при температуре 55 градусов Цельсия на термоблок при температуре 48 градусов Цельсия и уравновесьте в течение 10 минут. Пометьте дно стерильной чашки Петри. Если применимо, укажите коэффициент разбавления. Теперь выложите один миллилитр образца в середину чашки Петри. Закройте крышку. Снимите крышку с тюбика из расплавленного агара и пропустите ободок открытой тубы через пламя. Аккуратно высыпаем агар в чашку петри. Закройте крышку, затем смешайте образец с агаром, аккуратно поворачивая пластину. Подождите 30 минут, чтобы агар застыл. Как только агар застынет, переверните и поставьте тарелку в теплое помещение. Распыление направлено на отделение микроорганизмов, содержащихся в небольшом объеме образца, и равномерное распределение полученных колоний по поверхности агара. Отбалансируйте пластину до комнатной температуры и наклейте соответствующую этикетку. Расположите пластину на поворотном столе. Нанесите пипеткой 0,1 миллилитра образца на центр агара и закройте крышкой. Выбросьте наконечник в контейнер для отходов. Окуните металлический стержень в стакан с 70% этанолом, покрывающий всю нижнюю часть разбрасывателя и первый дюйм стебля, а затем слейте воду. Подожгите излишки этанола, пропустив через пламя горелки Бунзена. Далее откройте крышку агаровой пластины и охладите разбрасыватель, прикоснувшись им к агару по краю возле обода. Вращайте проигрыватель медленно. Осторожно удерживая разбрасыватель на поверхности агара, постепенно равномерно распределите образец по всей пластине с помощью движений вперед и назад, пока вращается поворотный стол. Закройте крышку и дайте образцу полностью впитаться в течение не менее пяти минут. Затем инкубируйте перевернутую пластину. Во-первых, нанесите соответствующую маркировку на агаровую пластину. Откройте крышку агаровой пластины. Затем откройте емкость с предварительно простерилизованными стеклянными бусинами и разогрейте ободок пламенем. Осторожно выложите от 10 до 12 стерильных стеклянных шариков на агаровую пластину. Закройте крышку тарелки и обжарьте край контейнера со стеклянными шариками, прежде чем установить крышку. Теперь нанесите образец пипеткой на центр агара. Горизонтальными движениями аккуратно встряхните бусины по поверхности агара семь раз. При правильном выполнении процедура звучит как встряхивание маракасов. Поверните тарелку на 60 градусов и снова встряхните в горизонтальном положении семь раз. Снова поверните тарелку на 60 градусов и повторите встряхивание. Убедитесь, что образец впитался. Затем высыпьте загрязненные шарики в помеченный стакан для сбора, содержащий 10% хлорного отбеливателя. Инкубируйте перевернутую тарелку. Анализ бляшек обычно используется для обнаружения и количественного определения фагов бактерий. Культивируйте индикаторные бактерии до экспоненциальной фазы и храните на льду. Затем пометьте две стерильные микроцентрифужные пробирки фагом и контролем и добавьте по 50 микролитров образца фага или буфера соответственно в каждую. Затем перемешайте бактериальную культуру в колбе, затем перенесите аликвоту бактерий в стерильную пробирку и аккуратно переведите индикаторные бактерии, затем добавьте по 500 микролитров бактерий в каждую абсорбционную пробирку. Перемешивайте, осторожно перелистывая трубочки. Никогда не делайте вихревыми или энергичными пипетками образцы фагов. Инкубируйте смесь фаговых бактерий при температуре, соответствующей индикаторному штамму, в течение 20 минут. Тем временем перенесите две мягкие агаровые трубки из водяной бани с температурой 55 градусов Цельсия в нагревательный блок с температурой 48 градусов Цельсия. Уравновесить в течение 10 минут. Нанесите этикетку на две не содержащие конденсации питательные твердые агаровые пластины, предварительно уравновешенные до комнатной температуры. Извлеките мягкую агаровую трубку из нагревательного блока и убедитесь, что содержимое не слишком горячее для прикосновения. Далее асептически перенесите смесь из фаговой абсорбционной трубки в мягкую агаровую трубку. Затем быстро вращайте между ладонями, чтобы перемешать содержимое. Держа трубку в одной руке, другой рукой откройте крышку пластины из жесткого агара. Сразу же высыпаем все содержимое тюбика на поверхность жесткой агаровой пластины. Покачивайте тарелку быстро и мягко. Закройте крышку и поставьте тарелку на уровень на 30 минут, пока мягкий агар не застынет. Далее повторите процедуру для управляющей абсорбционной трубки, переложив контрольную смесь в мягкую агаровую трубку. Перемешиваем его, выливаем содержимое на жесткую агаровую пластину, покачиваем ее и даем мягкому агару застыть в течение 30 минут. Осмотрите пластины на предмет образования зубного налета. Чтобы выделить зубной налет из гетерогенной смеси, осторожно проколите центр стерильной зубочисткой и перенесите инокулюм в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 микролитров фагового буфера. Продолжайте очищать этот лизат, повторяя анализ бляшек от трех до шести раз с последовательными разведениями по мере необходимости. Репликация использует селективный фенотип, позволяя сравнивать рост клеток на первичной пластине с вторичными пластинами. Отметьте сетку в нижней части пластины, подпишите основную пластину и пронумеруйте получившиеся квадраты. Теперь используйте асептический метод, чтобы извлечь предварительно стерилизованную зубочистку из стакана, промокните центр каждого квадрата образцом клеток и выбросьте зубочистку в соответствующий контейнер для отходов. Инкубируйте первичную пластину. Сложите основную пластину и все второстепенные пластины. Поместите ориентировочную метку сбоку нижней половины пластин. Теперь извлеките стерильную вельветовую салфетку из обертки и поместите ее на цилиндрический блок. Далее поместите держатель, совместив метки на держателе с метками на блоке. Обратите внимание на ориентировочную метку на блоке и держателе. Далее снимите крышку с основной пластины. Выровняйте ориентировочные метки на пластине и блоке. Опустите пластину так, чтобы поверхность агара соприкасалась с вельветовой тканью. Кончиками пальцев легко, но равномерно надавите на заднюю часть первичной пластины, а затем осторожно оторвите ее от блока. Подтвердите, что отпечаток ячеек можно увидеть на бархате. Установите на место крышку на тарелке. Теперь последовательно повторите протокол на вельветовой ткани с каждой из второстепенных пластин. Используйте бархатный оттиск клеток с первичной пластины, чтобы инокулировать до восьми вторичных пластин, упорядоченных от наименее до наиболее благоприятного субстрата. Наконец, в качестве положительного контроля, для последней пластины в серии, используйте агаровую среду, в которой должны расти все тестируемые штаммы. Склейте перевернутые пластины вместе и инкубируйте их. Осмотрите второстепенные пластины на предмет роста. Выключите горелку Бунзена и уберите все припасы. Поместите загрязненную лабораторную одежду, стеклянную посуду и опасные отходы в соответствующий контейнер для утилизации. Очистите рабочую зону дезинфицирующим средством. Наконец, тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой. Serratia Marcescens — грамотрицательная палочковидная протеобактерия, которая продуцирует красноватый пигмент под названием продигиозин. Его часто можно найти в ванных комнатах и на занавесках для душа. В этом примере метод полосовой пластины генерирует одиночные колонии в четвертом квадранте. В этом анализе бактерий, присутствующих в пробе воды, взятой из общественного питьевого фонтана, используется метод Pour Plate. Обратите внимание на разницу во внешнем виде колоний. Поверхностные колонии большие и круглые по форме, в то время как некоторые поверхностные колонии очень маленькие и неправильной формы. Метод Spread Plate является важным компонентом в экспериментах по обогащению, отбору и скринингу. Например, метод копакабана является дифференцирующим инструментом в классическом сине-белом экране в технологии рекомбинантной ДНК. Фаг Т4 представляет собой вирулентный фаг с двухцепочечной ДНК, который заражает своего хозяина в виде кишечной палочки для лизирования и высвобождения фага потомства. Этот анализ бляшек на агаре EHA показывает фаг в зонах очищения диаметром около одного миллиметра. В отсутствие инфицирующих фаговых частиц рост бактерий приводит к мутной суспензии клеток в мягком агаре, в которой дискретные колонии не видны. В технике наложения мягкого агара морфология зубного налета варьируется. Например, в данном случае один и тот же штамм микобактерий-хозяев продуцирует различные морфологии бляшек в присутствии фаговых разрушителей микробактерий по сравнению с микобактериальными фаговыми MSSS. Сила репликации покрытия заключается в одновременном скрининге большого количества микроорганизмов. В этом случае четыре штамма Pseudomonas были протестированы в двух экземплярах на предмет роста на трех различных источниках углерода. Ацетамид, лактоза и глицин. В данном случае первичная пластина представляет собой полную среду YTA, инокулированную четырьмя штаммами, как указано. Штаммы демонстрируют вариабельные модели роста на пластинах-репликах среды с минимальным содержанием MSA с добавлением одного источника углерода ацетамида, лактозы или глицина. Все штаммы растут на последней положительной контрольной пластине, подтверждающей, что клетки были перенесены на все вторичные пластины этой серии. В таблице этих точных результатов планшета подробно описан одновременный скрининг различных сортов дикого типа на наличие характерных требований к росту.

- После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять процедуры нанесения покрытий без загрязнения среды или культур, а также использовать подходящий метод нанесения покрытий для любой конкретной экспериментальной задачи в лаборатории. Чтобы овладеть этими техниками, требуется практика. Тем не менее, при правильном обучении процедуры нанесения покрытия, описанные в этом видео, станут второй натурой при работе на лабораторном стенде.