Флуоресцентный анализ с использованием сконструированных лимфоцитов для скрининга иммуномодулирующих соединений

Начните с совместимого с флуоресцентными материалами многолуночного планшета, содержащего суспензию трансгенных Т-лимфоцитов, полученных от мышей.

Эти лимфоциты содержат зеленый флуоресцентный белок или кассету экспрессии GFP, контролируемую Т-клеточным рецептором или взаимодействием TCR с иммуномодулирующими соединениями.

Обработайте каждую лунку раствором, содержащим иммуномодулирующие соединения с разным потенциалом.

Во время инкубации иммуномодулирующие соединения взаимодействуют с TCR на Т-лимфоцитах.

Взаимодействие TCR со стимулирующим соединением запускает активацию генной кассеты, повышая экспрессию GFP.

Напротив, взаимодействие TCR с ингибирующим соединением ингибирует генную кассету и снижает экспрессию GFP.

Затем покройте клетки флуоресцентным красителем на основе нуклеиновых кислот, чтобы окрасить ядра.

Центрифугируйте планшет, чтобы установить ячейки для точного измерения флуоресценции.

Под флуоресцентным микроскопом жизнеспособные Т-лимфоциты демонстрируют два флуоресцентных сигнала, соответствующих ядрам клеток и зеленым флуоресцентным белкам.

Усиленная зеленая флуоресценция свидетельствует об успешной стимуляции Т-лимфоцитов, в то время как слабый внутриклеточный сигнал зеленой флуоресценции подтверждает ингибирующее действие иммуномодулирующих соединений на Т-лимфоциты.

Для низкомолекулярного высокопроизводительного скрининга поместите 40 микролитров клеток в лунку в 384-луночный планшет и обработайте соответствующие лунки выбранным препаратом или носителем в течение желаемого периода лечения в инкубаторе для клеточных культур.

За 30 минут до анализа GFP окрасьте клетки соответствующей концентрацией раствора Хёхста, тщательно распределив пятно с помощью щадящего пипетирования. Когда все лунки будут окрашены, центрифугируйте планшеты, чтобы собрать клетки на дне лунок, и дайте им отдохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре.

Загрузите пластину в соответствии с инструкциями производителя. Затем установите цель на 40X или выше. Установите камеру No 4 для УФ-лампы, а затем установите камеру No 1 для лазера 488. Загрузите пластину в систему просеивания с высоким содержанием содержимого. Затем настройте автоматизированную конфокальную систему скрининга с высоким содержанием золота на считывание от 6 до 10 полей на лунку с двумя последовательными показаниями на поле на 488 нанометрах и в ультрафиолетовом свете.