Методика in vitro для изучения взаимодействия Т-клеток с поддерживаемыми планарными липидными бислоями

Возьмите проточную горку, содержащую поддерживаемый липидный бислой, или SLB.

SLB конъюгируется со специфическими лигандами — молекулой межклеточной адгезии 1 или ICAM-1 и анти-CD3 антителами — меченными флуорофорами.

Добавьте Т-клетки и меченный флуорофором анти-CD107a Fab — антигенсвязывающий фрагмент антитела против маркера дегрануляции.

Комплекс Т-клеточного рецептора-CD3 или TCR-CD3 связывается с анти-CD3 антителом, запуская TCR.

Индуцированная запуском передача сигналов изнутри наружу активирует интегрины на поверхности, которые связываются с иммобилизованным ICAM-1.

Конъюгация индуцирует перестройку цитоскелета — перестройку микротрубочек и полимеризацию актина, что приводит к латеральному распространению клетки по поверхности SLB.

Распространение позволяет большему количеству лиганд-рецепторных взаимодействий формировать супрамолекулярный активационный кластер или SMAC, создавая иммунный синапс.

Литические гранулы Т-клеток движутся по микротрубочкам и сливаются с плазматической мембраной, обнажая на поверхности клетки маркеры дегрануляции, которые связываются с анти-CD107a Fab.

С помощью флуоресцентного микроскопа визуализируйте иммунный синапс, обогащенный комплексами TCR-CD3, интегринами и маркерами дегрануляции.

Начните с использования полипропиленовых щипцов ножничного типа, чтобы погрузить стеклянные покровные стекла в свежеприготовленный кислотный раствор пираньи на 25-30 минут. В конце стирки прополощите покровные стекла семь раз в свежем объеме сверхчистой воды для каждой стирки и отложите влажные покровные стекла в сторону, чтобы оставшаяся вода скатилась с чистого стекла.

Когда покровные стекла высохнут, поместите два микролитра окончательной смеси липосом, а именно, в центр самоклеящегося канала предметного стекла внутри стерильного проточного капюшона, и немедленно, но осторожно, совместите один чистый и сухой покровный лист с предметным стеблем, чтобы позволить аккуратно опустить покровное стекло на липкую сторону предметного стекла, и используйте внешнее кольцо полипропиленовых щипцов ножничного типа, чтобы мягко надавить на периферический контакт предметного стекла. Покройте слайд слайдом, убедившись, что слип плотно прикреплен к слайду во избежание протекания. Затем переверните предметное стекло и с помощью перманентного маркера нарисуйте четыре точки вокруг бислоя на внешней стороне сборки предметного стекла.

Перед первой инъекцией назначьте один порт канала в качестве входного порта, а другой — в качестве выходного, сохраняя это назначение на протяжении всего эксперимента. Во избежание образования пузырьков вставьте конец наконечника пипетки непосредственно во входное отверстие до тех пор, пока не почувствуете, как резиновое уплотнение канала ползуна проникает наконечником.

Медленно заполните канал 50 микролитрами теплого буфера для анализа. Введите 200 микролитров хлорида никеля(II) в растворе, блокирующем казеин, во входной порт и удалите 50 микролитров буфера из выходного порта. После 45-минутной инкубации удалите излишки раствора казеина из выходного отверстия.

Введите 100 микролитров раствора ICAM-1 и стрептавидина во входной порт для 45-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации удалите излишки белкового раствора из выходного отверстия и промойте бислой два раза 100 микролитрами буфера для анализа на одну промывку. Затем пометьте бислои 100 микролитрами флуорофор-конъюгированного анти-CD3 антитела в течение 45 минут при комнатной температуре, после чего последует две промывки в 100 микролитрах буфера для анализа на одну промывку, как показано на рисунке.

Чтобы изобразить взаимодействие Т-клеток и бислоев, поместите предметное стекло на нагретый при температуре 37 градусов Цельсия столик микроскопа с полным внутренним отражением или TIRF и отрегулируйте предметный столик с помощью чернильных меток, чтобы центрировать бислой на объективе 100 степени.

Для визуализации высвобождения гранул добавьте флуоресцентно-конъюгированные фрагменты анти-CD107a антител Fab в суспензию CD4 Т-клеток и ресуспендируйте меченые клетки в 50 микролитрах буфера для анализа для введения во входной порт слайдового канала. Затем выберите подходящее количество экспериментальных полей и записывайте изображения каждого поля один раз в минуту в течение 30 минут после инъекции.