Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в нейронах с использованием сконструированных лентивирусов

Обрабатывайте прикрепленные плюрипотентные стволовые клетки человека сконструированными лентивирусами в реагенте для трансфекции.

Вирус несет гены устойчивости к антибиотикам и нейрогенный фактор транскрипции, контролируемый тетрациклин-чувствительными и регуляторными элементами.

Положительно заряженный реагент для трансфекции усиливает слияние вирусов и высвобождение их содержимого.

Вирусная РНК обратно транскрибируется в ДНК и интегрируется в ДНК стволовых клеток, обеспечивая экспрессию регуляторных элементов, которые продуцируют белки-активаторы.

Добавьте базальную среду с производным тетрациклина, которая образует комплекс с белками-активаторами.

Этот комплекс связывается с тетрациклин-чувствительным элементом, способствуя экспрессии генов и производя нейрогенные факторы транскрипции, которые индуцируют дифференцировку стволовых клеток в нейроны.

Добавьте базальную среду с антибиотическим препаратом для устранения нетрансфицированных клеток.

Обработайте клетки раствором для отслойки, содержащим протеолитические ферменты, которые разрушают внеклеточный матрикс или ВКМ и высвобождают клетки.

Удалите ферменты и повторно поместите клетки в лунки с покрытием ECM средой для созревания, способствуя созреванию нейронов.

За двое суток до индукции дифференцировки отделить ЭС клетки, добавив 1 миллилитр раствора для отслоения клеток, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Переложите клетки в пробирку. Затем промойте колодец 2 миллилитрами среды и добавьте ее в ту же трубку. Центрифугируйте клетки при 300 умноженных на г в течение 5 минут. Затем повторно суспендируйте гранулу в среде и наложите ячейки на шестилуночные планшеты с матричным покрытием с плотностью посадки от 1 умножить на 10 до пятой ячейки на лунку.

На следующий день добавьте лентивирусы, экспрессирующие Ngn2 плюс PuroR, и трансактиватор тетрациклина вместе с полибреном в свежую среду для поддержания ES-клеток. В нулевой день добавьте 2 мкг на миллилитр доксициклина в среде DMEM/F12 с добавлением N2 и без морфогенов. В первый день добавьте пуромицин в свежий DMEM/F12 плюс N2 и доксициклин до конечной концентрации 1 микрограмм на миллилитр.

Отбирайте трансдуцированные клетки в пуромицине в течение не менее 24 часов. На второй день отделите дифференцирующие нейроны раствором для отслойки клеток и поместите их на 24-луночные планшеты, покрытые матричным раствором. Поддерживайте их в среде NBA/B27 без доксициклина. Культура чистых индуцированных нейронов на пластинах, покрытых растворами на основе внеклеточного матрикса.