Визуализация и картирование нейронных путей в срезе миндалевидного тела

В мозге мыши миндалевидное тело содержит нейроны, которые образуют синаптические связи с медиальной префронтальной корой, или нейронами mPFC.

Возьмем срез миндалевидного тела, в котором нейроны mPFC экспрессируют светочувствительный канал родопсин, слитый с флуоресцентным белком.

Поместите срез в записывающую камеру и визуализируйте его под флуоресцентным микроскопом, чтобы найти нейроны mPFC.

Переключитесь на светлое поле и введите патч-пипетку, содержащую внутренний раствор.

Приложите положительное давление, чтобы продвинуть пипетку к нейрону миндалевидного тела.

При контакте с нейронами образуется ямочка.

Нанесите всасывание, чтобы сформировать плотное уплотнение.

Продолжайте отсасывание, чтобы разорвать мембрану, установив контакт с внутренней частью клетки.

Осветите срез, чтобы активировать нейрональный канал mPFC родопсин, запуская положительный приток ионов, генерацию потенциала действия и высвобождение нейротрансмиттеров.

Нейротрансмиттеры связываются с рецепторами нейронов постсинаптического миндалевидного тела, вызывая приток ионов и генерацию тока.

Запишите постсинаптический нейронный ток для анализа связи mPFC-миндалевидное тело.

Чтобы подготовить патч-микроскоп к оптогенетической активации волокон и клеток, центрируйте установленный светодиод (LED) на пути доставки света. Используйте измеритель мощности для измерения интенсивности светодиодного света в задней фокальной плоскости и на выходе каждого объектива на длине волны 470 нанометров. Используйте электронную таблицу для расчета интенсивности света в милливаттах на квадратный миллиметр и создайте калибровочную кривую для каждого объектива.

Затем извлеките острый срез миндалевидного тела из интерфейсной камеры и поместите его в камеру среза, установленную на микроскопе. Расположите срез таким образом, чтобы поверхность среза, обращенная вверх в камере интерфейса, также была направлена вверх в камере записи. Перфузируйте ломтик свежим, насыщенным кислородом ACSF со скоростью от 1 до 2 миллилитров в минуту. Температура должна быть примерно 31 градус по Цельсию. Включите люминесцентную лампу и выберите подходящие наборы фильтров для конкретного экспрессируемого флуоресцентного белка. Используйте цель 5x для получения обзора.

Затем откройте или ограничьте отверстие в световом тракте микроскопа, если это необходимо для проведения эксперимента. Чтобы получить патч-запись, заполните патч-пипетку внутренним раствором и установите ее в держатель электродов. Приложите положительное давление к пластырной пипетке, и медленно опустите ее в раствор для ванны. Затем под визуальным контролем с помощью микроманипулятора опустите патч-пипетку в срез. Подойдите к интересующему нейрону с помощью патч-пипетки сбоку и сверху.

Сбросьте положительное давление, когда пипетка достигнет поверхности ячейки, на что указывает ямочка, видимая на поверхности ячейки. Приложите отрицательное давление, чтобы получить гигаseal. Примените дополнительную аспирацию, чтобы разорвать мембранный пластырь и получить запись всей клетки. Затем стимулируйте помеченные волокна с помощью подключенного светодиода, активируя каналродопсин светом с длиной волны 470 нанометров, записывая электрические ответы клетки.

Для синаптической стимуляции используйте цифровые выходы программного обеспечения для сбора данных, чтобы запустить светодиод. Отрегулируйте интенсивность светодиодной стимуляции вручную. Повторите стимуляцию с открытой или ограниченной апертурой, если это необходимо для следующей зарегистрированной ячейки или в присутствии определенных испытуемых веществ.