Создает FSL: Простой метод Изменение Cell / Вирион Поверхности со спектром биологических маркеров не влияя на их жизнеспособность

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы безвредно и быстро пометить поверхности живых клеток или S биологически активными конструкциями. Это достигается путем предварительной подготовки функционального спейсера, липидного или конструкционного раствора FSL. Далее равная часть конструктного раствора смешивается с равной частью раствора клеток или ВИР.

В качестве третьего шага смесь инкубируется в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Последним шагом является промывка модифицированных клеток или цитов или модифицированных ВИР или ВИР и их использование в эксперименте как обычно. В конечном счете, поверхностно модифицированные живые клетки или S могут быть визуализированы с помощью всех стандартных методов экспериментального анализа, включая проточную цитометрию, микроскопию и агглютинацию.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как ковалентное мечение, заключается в том, что она быстрая, надежная, гибкая и не влияет на жизнеспособность модифицированной клетки или вариана. Чтобы сначала приготовить исходный раствор FSL, добавьте один миллилитр разбавителя в файл продукта, чтобы восстановить сухой продукт FSL, получив один миллиграмм на миллилитр исходного раствора. Проработайте флакон ультразвуком в течение 30 секунд, разлейте бульон по 100 микролитровым стерильным контейнерам и храните контейнеры при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение одной недели.

Чтобы приготовить рабочие растворы конструкций FSL для введения, непосредственно перед использованием снова произведите ультразвуковую обработку раствора в течение 30 секунд для гомогенизации любых мис-клеток, затем разбавьте конструкцию и буфер FSL до требуемой концентрации. Храните рабочий раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение недели после суспензии Resus в среде без липидов или центрифугируйте PBS элементы для модификации FSL без несвязанных липидов. Затем упакуйте клетки в 100 микролитров разбавителя, промойте клетки для контроля в тех же условиях до 100 микролитров немодифицированных клеток.

По желанию добавьте 100 микролитров соответствующего разбавления раствора ФСЛ. Параллельно также создавайте негативные элементы управления с помощью несвязанных решений FSL и/или PBS. Затем инкубируйте все подгруппы клеток в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия после инкубации.

Дважды промойте все ячейки безлипидной средой или PBS, чтобы удалить все свободные конструкции FSL и приготовить соответствующую суспензию в безлипидной среде. После того, как процесс модификации FSL будет завершен, кои могут храниться при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия, как цветок. Конструкции FSL состоят из трех основных компонентов, функциональной головки или F, которые могут быть разнообразными биологически функциональными группами.

Спейсер RS разработан таким образом, чтобы индуцировать расстояние между функциональной головкой и мембраной, чтобы улучшить дисперсию воды и не вступать в реакцию с сывороткой крови человека и липидом или L-кислотой DAL, что позволяет конструкции самопроизвольно встраиваться в четыре поверхности. Репрезентативные группы FSL показаны на следующих пяти изображениях. Живые эмбрионы мышей были непосредственно помечены флуоресцеином FSL в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в среде свободных клеточных культур сыворотки, промытых и затем просматриваемых под флуоресцентной микроскопией.

На этом первом изображении можно увидеть двухклеточный зеркальный эмбрион zop palita. Интенсивное окрашивание в середине эмбриона является типичным для классического окрашивания полярным телом. На следующих двух изображениях zop palita свободны от четырех клеток и восьми клеток зеркального отражения эмбрионов, которые демонстрируют темное окрашивание клеток, находящихся за пределами фокуса микроскопа.

Изображение 16-клеточного зеркального эмбриона zop palita показано на этом последнем изображении живых зеркальных эмбрионов FSL, меченных флуоресцеином, четырех-пятидневных неповрежденных зеркальных бластных эмбрионов с мечеными эмбрионами и zop LUCITA показаны в следующей серии изображений. Показано флуоресцеиновое мечение ФСЛ рыбок данио-рерио. Это первое изображение представляет собой микроангиографию личинок данио-рерио через 52 часа после оплодотворения, которым флуоресцеин FSL был введен непосредственно в кровоток.

Здесь можно наблюдать окрашивание сосудистой сети рыбок данио. Флуоресцеин FSL, гетерогенные клетки почечной ткани данио-рерио или циты ZK были созданы exvivo, а затем микроинъекции введены в циркуляцию реципиента данио-рерио in vivo наблюдения за цитами ZK через два часа после инъекции путем визуализации сосудистой сети под флуоресценцией с интервальной микроскопией, показан один видеокадр с большими медленно движущимися или неподвижными клетками, обозначенными оранжевыми стрелками, и быстро движущимися клетками, которые казались размытыми из-за их движения, обозначенного зелеными стрелками. На этом изображении показано мечение флуоресцеином FSL путем перорального поглощения конструкции, полученное путем погружения эмбрионов рыбок данио и FSL-содержащей флуоресцеинной среды на срок до пяти дней.

Светлопольная микроскопия обработанной флуоресцеином рыбки данио (слева) соответствует соседнему флуоресцентному изображению справа. Флуоресценция преимущественно располагалась в кишечном тракте. У показанных здесь необработанных контрольных эмбрионов окрашивания не наблюдалось.

Здесь вирус везикулярного стоматита или VSV непосредственно мечится 10 мкг на миллилитр флуоресцеина FSL в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с последующей фиксацией 4%-ным параформным альдегидом, а затем анализ по факту сканирования показывает отсутствие очистки VSV vir. Требовалась маркировка после FSL. На этой гистограмме показаны клетки яичек свиньи, инфицированные человеческим A Puerto Rico 8 19 34 или H one N one VIRs, меченными флуоресцеином FSL.

Нефлуоресцентные неинфицированные клетки обозначены черной линией, в то время как слияние H one N one coron с клетками свиньи, в результате которого произошла флуоресценция, обозначено красной линией. В этой следующей серии изображений клетки сначала были помечены биотином FSL в течение одного часа при 37 градусах Цельсия, затем промыты и прореагировали с Fluor 4 меченным авадоном, а затем промыты и увлажнены для флуоресцентной микроскопии. На первом изображении показано скомпилированное конфокальное изображение вспышек помощи эмбриона мыши, а на этом рисунке показан центральный конфокальный срез эмбриона с предыдущего изображения.

Здесь живут подвижные люди perm zoa. Размытие происходит как следствие их движения. Более отчетливое репрезентативное изображение сперматозоидов человека, зафиксированных в 4%-ном параформном альдегиде после введения, можно увидеть на этом рисунке здесь.

Показано, что меченные биотином ФСЛ эритроциты человека фиксируются с помощью введения 4% параформного альдегидного преса не влияет на мечение ФСЛ, как показано на следующих двух рисунках здесь, можно наблюдать 4% пармальные фиксированные клетки RL 95 эндометрия карциномы человека. В то время как на этом изображении клетки карциномы эндометрия человека RL 95 не зафиксированы. Практически не наблюдается различий в маркировке между двумя изображениями с фиксацией или без нее.

Меченные биотином ФСЛ цитаты эритроцитов, обнаруженные в образце крови, взятом через два часа после внутривенной инфузии цитов, показаны здесь слева, клетки были рассмотрены под световой микроскопией справа, то же поле клеток было рассмотрено при флуоресценции, и два присутствующих цита могут быть идентифицированы зеленым цветом. Расчет соотношения цитов к немеченым клеткам может быть использован в качестве показателя выживаемости. На этом последнем изображении клетки, меченной биотином FSL, показаны живые циты биотина эндометрия человека, которые были визуализированы путем связывания с уменьшенными гранулами.

Эта последняя серия изображений показывает взаимодействие конструктов FSL с маркерами групп крови. На первом изображении изображены цитаты эритроцитов человека, покрытые концентрацией FSLG в концентрации 500 микрограммов на миллилитр, протестированные на разведениях сыворотки крови человека. Эритроциты человека естественным образом не реагируют с антигеном Xena GALI.

Таким образом, циты могут быть использованы для количественного определения уровня антител в сыворотке. В этом примере у пациента был определен титр антига от одного до 32 путем создания цитов со снижением уровня FSL. Аналогично созданию титра антигена, может быть определен оптимальный уровень антигена для обнаружения антител, могут быть созданы клетки, дающие положительный результат только тогда, когда уровень антител превышает определенный титр.

Уровень антигена FSL, необходимый для получения положительного результата, зависит от качества и уровня обнаруживаемых антител. Как правило, для углеводных антигенов раствор FSL в концентрации 100 микрограммов на миллилитр приведет к сильной положительной реакции. Эритроциты группы О человека модифицированы для получения определенного уровня антигена или так называемые стандартизированные.

Циты используются для точного и воспроизводимого количественного определения антии в сыворотке крови человека. В этом примере циты были получены из собственных эритроцитов донора, и уровень антиа в тестируемой сыворотке группы О был обнаружен равным 1 к 32. Показанные здесь в шестой пробирке антигены крови групп А и В, одновременно вставленные в один образец эритроцитов группы О, были использованы для создания недельных цитат.

Эти циты могут быть использованы для контроля качества VO. Анализ специально разработанного недельного цитата, протестированного на антиа и анти В реагентах, дает ожидаемые слабые реакции, как видно на этом рисунке, с реакциями, происходящими в средней нижней области пробирок. Эту простую технику можно выполнить за два часа, если ее правильно выполнить.