Создает FSL: Простой метод Изменение Cell / Вирион Поверхности со спектром биологических маркеров не влияя на их жизнеспособность

Общая цель данной процедуры заключается в безопасном и быстром мечении поверхностей живых клеток или S биоактивными конструктами. Для этого сначала подготавливают раствор функционального спейсера, липида или конструкции FSL. Затем равную часть раствора конструкта смешивают с равной частью суспензии клеток или VIR.

На третьем этапе смесь инкубируют в течение 60 минут при 37 °C. Заключительный этап заключается в промывке модифицированных клеток или цитов, либо модифицированных VIR или VIR, после чего их используют в экспериментах в обычном режиме. В конечном итоге поверхностно модифицированные живые клетки или S можно визуализировать с помощью всех стандартных методов экспериментального анализа, включая проточную цитометрию, микроскопию и агглютинацию.

Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как ковалентное мечение, является то, что он быстрый, надежный, гибкий и не влияет на жизнеспособность модифицированной клетки или организма. Чтобы приготовить исходный раствор конструкции FSL, сначала добавьте один миллилитр разбавителя во флакон с продуктом для восстановления сухого продукта FSL, создав исходный раствор с концентрацией 1 mg/mL. Обработайте флакон ультразвуком в течение 30 секунд, разлейте исходный раствор аликвотами по 100 µL в стерильные контейнеры и храните контейнеры при температуре от 2 до 8 °C не более одной недели.

Для подготовки рабочих растворов конструктов FSL непосредственно перед введением снова обработайте раствор ультразвуком в течение 30 секунд для гомогенизации любых агрегатов клеток, затем разведите конструкт FSL и буфер до требуемой концентрации. Храните рабочий раствор при температуре от двух до восьми градусов Цельсия до одной недели. После ресуспендирования в безлипидной среде или PBS центрифугируйте клетки для модификации FSL, чтобы избавиться от несвязанных липидов. Затем осадите клетки в 100 µL разбавителя; промойте клетки для контрольных групп в тех же условиях до получения 100 µL немодифицированных клеток.

При желании добавьте 100 µL соответствующего разведения раствора FSL. Параллельно создайте отрицательные контроли с нерелевантными растворами FSL и/или PBS. Затем инкубируйте все подмножества клеток в течение одного часа при 37 °C после инкубации.

Дважды промойте все клетки безлипидной средой или PBS, чтобы удалить свободные конструкции FSL, и приготовьте соответствующую суспензию в безлипидной среде. После завершения процесса модификации FSL клетки можно хранить при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия. Конструкции FSL состоят из трех основных компонентов: функциональной головки или F, которая может представлять собой различные биологически функциональные группы.

Спейсер RS разработан для того, чтобы обеспечить удаление функциональной головки от мембраны с целью улучшения дисперсности в воде, а также для обеспечения отсутствия реакционной способности по отношению к сыворотке крови человека и липиду DAL или L, что позволяет конструкции спонтанно встраиваться в поверхности четыре. Репрезентативные группы FSL показаны на следующих пяти изображениях. Живые эмбрионы мышей были напрямую помечены FSL-флуоресцеином методом выдержки в течение двух часов при 37 °C в безсывороточной среде для культивирования клеток, после чего их промыли и исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии.

На этом первом изображении виден двухклеточный зеркальный эмбрион zop palita free. Интенсивное окрашивание в центре эмбриона характерно для классического окрашивания полярного тельца. На следующих двух изображениях представлены зеркальные эмбрионы zop palita free на стадиях четырех и восьми клеток, демонстрирующие призрачное окрашивание клеток, находящихся вне плоскости фокусировки микроскопа.

На этом последнем изображении представлен эмбрион на стадии 16 клеток с зеркальным отражением, не имеющий zop palita. Далее следует серия изображений неповрежденных зеркальных бластул эмбрионов в возрасте четырех-пяти дней, где как эмбрионы, так и zop LUCITA помечены FSL-флуоресцеином. Показано флуоресцентное мечение FSL zebrafish. На первом изображении представлена микроангиография личинки zebrafish через 52 часа после оплодотворения, в кровоток которой был введен FSL-флуоресцеин.

Здесь представлено окрашивание сосудов зебрафиша. Флуоресцеин FSL, гетерогенные клетки тканей почек зебрафиша или циты ZK были созданы ex vivo, а затем введены путем микроинъекции в кровоток реципиента-зебрафиша через 52 часа после оплодотворения. Наблюдения за цитами ZK в условиях in vivo проводились через два часа после инъекции с помощью флуоресцентной визуализации сосудов методом таймлапс-микроскопии. Показан отдельный кадр видео, где крупные медленно движущиеся или неподвижные клетки отмечены оранжевыми стрелками, а быстро движущиеся клетки, которые выглядят размытыми из-за перемещения, — зелеными стрелками. На данном изображении показано мечение флуоресцеином FSL путем перорального поглощения конструкта, достигнутого путем погружения эмбрионов зебрафиша в среду, содержащую флуоресцеин FSL, на срок до пяти дней.

Изображение эмбриона данио-рерио, обработанного флуоресцеином FSL, полученное методом светлопольной микроскопии (слева), соответствует соседнему флуоресцентному изображению (справа). Флуоресценция преимущественно локализовалась в кишечном тракте. В необработанных контрольных эмбрионах, показанных здесь, окрашивания не наблюдалось.

Здесь представлен вирус везикулярного стоматита (VSV), который был напрямую помечен флуоресцеином FSL в концентрации 10 µg/mL в течение двух часов при 37 °C с последующей фиксацией 4% параформальдегидом и анализом методом проточной цитометрии; очистка вирионов VSV после маркировки FSL не требовалась. На данной гистограмме показаны клетки семенников свиньи, инфицированные вирионами человеческого штамма A Puerto Rico 8 19 34 или H1N1, помеченными флуоресцеином FSL.

Нефлуоресцирующие неинфицированные клетки обозначены черной линией, а слияние коронавируса H1N1 со свиными клетками, приведшее к флуоресценции, отмечено красной линией. На следующей серии изображений клетки сначала маркировали FSL-биотином в течение одного часа при 37 °C, затем промыли и подвергли реакции с меченым Fluor 4 авидином, после чего снова промыли и смонтировали в капельном препарате для флуоресцентной микроскопии. На первом изображении представлено комбинированное конфокальное изображение бластоцисты эмбриона мыши, а на данной фигуре показан центральный конфокальный срез эмбриона с предыдущего изображения.

На данном изображении представлены живые подвижные сперматозоиды человека. Размытость является следствием их движения. Более четкое репрезентативное изображение сперматозоидов человека, фиксированных в 4% параформальдегиде после введения, можно увидеть на этой фигуре здесь.

На изображениях представлены эритроциты человека, меченные FSL-биотином; показано, что фиксация 4% параформальдегидом перед введением не влияет на FSL-мечение, что иллюстрируется на следующих двух рисунках. Здесь представлены клетки карциномы эндометрия человека линии RL 95, фиксированные 4% параформальдегидом. В то время как на этом изображении клетки карциномы эндометрия человека RL 95 не фиксированы. Практически никаких различий в мечении между двумя изображениями (с фиксацией и без нее) не наблюдается.

Слева представлены RBC-циты, меченные FSL-биотином, которые наблюдались в образце крови, взятом через два часа после внутривенного введения цитов; справа те же клетки были рассмотрены с помощью световой микроскопии, а затем то же поле клеток было рассмотрено с помощью флуоресценции, где два присутствующих цита идентифицированы зеленым цветом. Расчет соотношения цитов к немеченным клеткам может быть использован в качестве индикатора выживаемости. На последнем изображении представлены живые биотиновые циты эндометрия человека, меченные FSL, которые были визуализированы путем связывания с авидин-биотиновыми микросферами.

Эта заключительная серия изображений демонстрирует взаимодействие конструктов FSL с маркерами групп крови. На первом изображении представлены гликоциты эритроцитов человека, покрытые FSLG в концентрации 500 µg/mL, протестированные с разведениями сыворотки крови человека. Эритроциты человека естественным образом не реагируют с антигеном GALI.

Таким образом, циты можно использовать для количественного определения уровней антител в сыворотке. В данном примере было установлено, что титр антигена у пациента составляет от 1 к 32; это было достигнуто путем создания цитов с понижающимися уровнями FSL. Аналогично определению титра антигена, можно установить оптимальный уровень антигена для обнаружения антител, создавая клетки, которые дают положительный результат только тогда, когда уровень антител превышает определенный титр.

Уровень антигена FSL, необходимый для получения положительного результата, зависит от качества и концентрации определяемых антител. Обычно для углеводных антигенов раствор FSL в концентрации 100 micrograms per milliliter вызывает сильную положительную реакцию. Эритроциты человека группы O, модифицированные для достижения определенного уровня антигена или так называемые стандартизированные.

Клетки-индикаторы используются для точного и воспроизводимого количественного определения анти-А в сыворотке крови человека. В данном примере клетки-индикаторы были приготовлены из собственных эритроцитов донора, и уровень анти-А в тестируемой сыворотке группы О составил от 1 до 32. Здесь, в шестой пробирке, антигены групп крови А и В, одновременно введенные в один образец эритроцитов группы О, были использованы для создания слабых А и слабых В клеток-индикаторов.

Данные клетки могут быть использованы для целей контроля качества VO. Анализ специально подготовленных клеток групп A-слабый и B-слабый при тестировании с реагентами анти-A и анти-B дает ожидаемые слабые реакции, как показано на данном рисунке, при этом реакции происходят в нижней средней части пробирок. Эта простая процедура может быть выполнена за два часа при условии правильного ее проведения.