Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

В этом видео показана процедура определения жизнеспособности клеток в клетках, экспрессирующих GFP, с использованием цитометра, основанного на счетном изображении. Трансдуцированные GFP клетки окрашиваются с помощью набора для подсчета жизнеспособности мертвых клеток в красный цвет, который окрашивает все мертвые клетки в красный цвет йодидом пропидия, клетки пипетируются в предметное стекло для клеточного анализа и загружаются в цитометр, который получает и анализирует светлопольные и красные и зеленые флуоресцентные изображения. Затем генерируются гистограммы для отображения количества клеток, размера клеток, интенсивности флуоресценции PI и интенсивности флуоресценции GFP по сравнению с традиционной проточной цитометрией.

Tali может предоставить аналогичные данные о жизнеспособности и экспрессии клеток. Тем не менее, эта цитометрия на основе изображений предоставляет дополнительную визуальную информацию об исследуемой популяции клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как проточная цитометрия или флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что цитометр на основе счетного изображения предоставляет одновременно количественную и визуальную информацию о образце клетки.

Кроме того, прибор для подсчета очков проще в использовании, дешевле и занимает меньше места, чем проточный цитометр или флуоресцентный микроскоп. Это позволяет исследователям быстро проводить количественные анализы, такие как жизнеспособность клеток, экспрессирующих GFP, на настольных компьютерах. В этой процедуре клетки U2 OS в концентрации от 10 до 6 клеток на миллилитр трансдуцировали с помощью вирусной конструкции GFP из ядерной таргетной клетки для поддержания мертвых клеток с помощью йодида пропидия и переноса 100 микролитров клеточной суспензии в новую микроцентрифужную пробирку.

Обратите внимание, что для анализа рекомендуется концентрация от 10 до 10 до 10 до 7 клеток на миллилитр, хотя концентрация не обязательно должна быть точной. Далее добавьте один микролитр реактива для подсчета мертвых клеток красного цвета. Затем вихрь ненадолго перемешать, инкубировать окрашивающий реагент и клеточную смесь при комнатной температуре в темноте от одной до пяти минут.

После инкубации немедленно приступают к анализу на основе табельного изображения цитометра. Для подсчета используются одноразовые пластиковые предметные стекла для клеточного анализа, разработанные специально для прибора. Всегда держите слайд за края, чтобы загрузить слайд

Медленно внесите 25 микролитров образца в одну из областей загрузки образца в форме полумесяца. Здесь неокрашенные нонт-трансдуцированные контрольные клетки загружаются в камеру А, а окрашенные клетки, экспрессирующие GFP, загружаются в камеру B.To проведения анализа жизнеспособности в клетках, экспрессирующих GFP, касаются G-F-P-R-F-P на главном экране цитометра. После этого справа появятся варианты анализа: выберите GFP плюс жизнеспособность.

Затем прибор спросит о том, следует ли называть серию образцов, чтобы назвать серию образцов. Нажмите имя сейчас. Затем с помощью сенсорного экрана введите название серии образцов и нажмите «Сохранить», таальный цитометр автоматически перейдет к экрану измерения.

Затем, чтобы измерить флуоресценцию фона, нажмите вкладку фона в нижней правой половине экрана измерения, как показано здесь. Настройка по умолчанию указывает, что будут отображаться девять полей ячеек. Теперь, когда контрольный образец обращен в сторону от прибора, вставьте предметное стекло в загрузочное отверстие до упора.

Не прикладывайте усилие к фоновому экрану, нажмите на кнопку, чтобы вставить новую неокрашенную ячейку управления. Слайд будет автоматически втянут в прибор, и на экране будет отображаться живое изображение ячеек. С помощью ручки фокусировки выведите ячейки в правильную плоскость обзора во время фокусировки.

Сдвиньте красную кнопку масштабирования в четыре или 16 раз. Чтобы лучше рассмотреть популяцию клеток, клетки должны быть равномерно темными с ярким ореолом вокруг каждой. Как показано здесь, ячейки могут быть недосчитаны, когда переход между фоном и краями ячеек нечеткий, так что границы ячеек не очень четко определены.

Клетки могут быть пересчитаны, когда у них светлые центры и темные периметры. После того, как клетки будут сфокусированы, коснитесь и нажмите, чтобы запустить контроль неокрашенных клеток. Чтобы измерить фоновую флуоресценцию, цитометр будет автоматически захватывать изображения и отображать миниатюры каждого поля зрения.

Индикатор выполнения обеспечивает постоянное обновление анализа. После завершения съемки цитометр автоматически извлекает предметное стекло и предоставляет данные анализа полученных изображений. Сохраненные данные отображаются в выпадающем меню фоновой вкладки.

Образцу фонового контроля будет присвоено то же имя, что и образцу, присвоенному эксперименту. Чтобы запустить образец, окрашенный PI GFP, извлеките предметное стекло из прибора, переверните его и снова вставьте так, чтобы преобразованный образец был обращен в сторону от инструмента. Нажмите на вкладку образца, а затем нажмите «Нажать», чтобы вставить новый образец.

Когда изображение появится на экране, используйте ручку фокусировки, чтобы сфокусировать ячейки. Как и раньше, затем нажмите «Нажмите», чтобы запустить образец. После завершения съемки изображения данные анализа появляются на вкладке образца, и цитометр автоматически извлекает предметное стекло соответствующим образом.

Утилизируйте предметное стекло для количественного анализа. Поскольку эти горки являются биологически опасными отходами, их нельзя использовать повторно. После выполнения выборки к выборке можно применить пороговые значения.

Чтобы проанализировать конкретные клеточные популяции, мы настроим пороговые значения, чтобы определить процент живых и мертвых клеток. В клетках, экспрессирующих GFP, на вкладке образца указывается количество и процент клеток, экспрессирующих GFP, живых и мертвых клеток, экспрессирующих общую жизнеспособность GFP. Отображается средний размер клетки, количество подсчитанных клеток и концентрация клеток.

Кроме того, в нижней части экрана отображаются гистограммы, отображающие размер ячейки, зеленую флуоресценцию и красную флуоресценцию. Чтобы установить гейт размера ячейки, коснитесь миниатюры размера ячейки, чтобы открыть гистограмму размера ячейки и исключить мусор. Переместите синие ползунки, чтобы исключить как большие, так и маленькие события.

Нажмите Применить, чтобы включить ячейки внутри ворот. Далее, чтобы добавить флуоресценцию GFP к анализу, коснитесь миниатюры гистограммы GFP. Чтобы открыть его.

Переместите синюю ползунок, чтобы установить порог справа от самого тусклого пика. Используйте контрольный образец в качестве руководства. Это позволяет включить в анализ GFP-положительные клетки, но исключить автофлуоресцентные клетки.

Автофлуоресценция часто наблюдается, когда биологические молекулы в клетках обрабатываются Excel Touch для подтверждения и возврата к предыдущему экрану. Данные, отображаемые на вкладке образца, теперь должны отражать вентили и пороговые значения, установленные для обоих флуоресцентных каналов. Затем, чтобы отделить клетки окрашивания PI от автофлуоресценции или любого фона, присутствующего в образце, нажмите миниатюру гистограммы PI, чтобы открыть ее снова.

Пик контрольной выборки будет отображаться на гистограмме в виде серого пика. Красный пик — это флуоресценция образца. Фоновая флуоресценция отображается в виде пика, ближайшего к нулевому значению RFU на данном приборе.

Чтобы устранить фоновую флуоресценцию в канале PI, переместите синюю ползунок, чтобы настроить порог. Чтобы исключить этот пик, используйте серый пик из контрольной выборки в качестве эталона. Если пороговое значение в канале PI установлено правильно, нажмите «Применить» для подтверждения и вернитесь к предыдущему экрану, прибор световой индикации снова автоматически повторно проанализирует данные и обновит результаты на вкладке образцов.

Далее, чтобы визуально убедиться в правильности назначения каждой ячейки, нажмите вкладку масштабирования, затем выберите захваченное поле зрения для просмотра, нажав на миниатюру изображения. Затем нажмите на вкладку слоев. Затем нажмите кнопку GFP или PI, чтобы отобразить изображение, снятое через этот канал.

Нажмите ту же кнопку еще раз, чтобы удалить слой с дисплея или наложить слои, коснитесь кнопок, соответствующих каждому каналу, чтобы определить, как подсчитываются ячейки по тому или иному каналу. На ощупь обводятся клетки, которые были подсчитаны только по каналу яркого поля, которые не выражают флуоресценцию, будут обведены синим цветом. Это указывает на то, что конкретная клетка – это живые клетки, экспрессирующие в зеленом канале.

GFP будет обведен зелеными клетками, выраженными в красном канале. Окрашенные цифрой пи будут обведены красным цветом, и мертвые клетки будут подсчитаны в обоих случаях. Красный и зеленый каналы будут обведены желтым цветом.

Это указывает на то, что клетка экспрессирует GFP, но также окрашена pi и, следовательно, мертва. Время от времени на экране будет появляться черный круг. Это объекты, которые были идентифицированы, но были исключены из анализа на основании размера ячейки.

Продолжайте тонкую настройку порога на гистограмме флуоресценции, используя только что описанные шаги, пока каждая ячейка, выражающая флуоресценцию, не будет обведена соответствующим цветом. Все параметры анализа автоматически сохраняются в приборе. Под краном данных.

На счетной подсчетной ведомости могут храниться файлы данных из 500 прогонов образцов. Каждый файл, хранящийся на вкладке данных, доступен для повторного анализа. При выборе файла на вкладке данных он будет снова открыт, и все гистограммы и слои станут активными для архивирования данных и создания отчетов.

Данные, хранящиеся в приборе, могут быть переданы на компьютер с помощью USB-накопителя. Четыре репрезентативных типа клеток были трансдуцированы с помощью ядерного таргетного клеточного света, вирусной конструкции GFP, окрашенной набором для подсчета жизнеспособности с использованием красного реагента мертвых клеток, и проанализированы с помощью подсчета в проточном цитометре, как показано здесь. Оба метода показали примерно одинаковый процент популяции для каждого типа клеток, экспрессирующих GFP, а также процент от общей популяции, которые были жизнеспособны и экспрессировали GFP.

Эти данные демонстрируют, что цитометр Tali способен различать общую экспрессию GFP в популяции и экспрессию GFP в живой популяции. Мы только что продемонстрировали, как использовать цитометр на основе счетного изображения для оценки экспрессии флуоресценции и жизнеспособности в образце клетки. Эта технология устраняет разрыв между индивидуальными и популяционными исследованиями клеток.

Используя цитометр на основе счетного изображения, вы можете собирать количественную и качественную визуальную информацию об отдельных клетках, а также о более крупных клеточных популяциях. Используя ту же процедуру, можно провести несколько других анализов, включая апоптоз, экспрессию RFP и жизнеспособность клеток.