Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Общая цель этой процедуры заключается в успешной визуализации фильтрационной установки нефрона и количественной оценке фильтрации флуоресцентных макромолекул через фильтрационный барьер в мочевое пространство in vivo. Это достигается путем предварительной подготовки предметного столика микроскопа для живого животного. Далее почка обнажается, и крысу помещают на сцену.

Затем идентифицируются и картографируются отдельные клубочки, а также получаются фоновые 3D-изображения. Наконец, вводится флуоресцентный альбумин. Получены 3D-объемы отдельных клубочков и количественно определена проницаемость.

В конечном счете, можно получить результаты, показывающие коэффициент фильтрации макромолекул через клубочки в почках с помощью внутрифлаконной двухфотонной микроскопии. Основное преимущество двухфотонной микроскопии заключается в том, что она позволяет одновременно количественно оценить как клубочковую фильтрацию, так и реабсорбцию и трансцитоз проксимальных канальцев у животного. В то же время, последствия этого метода выходят за рамки механистических и становятся диагностическими и терапевтическими, поскольку важно понимать как роль клубочковой фильтрации, так и проксимальных канальцев.

Реабсорбция альбумина имеет решающее значение для определения таргетности терапии. После обезболивания крысы вставьте внутреннюю венозную линию через яремную или бедренную вену и побрейте левый бок от чуть ниже грудной клетки до чуть выше левого бедра. Это операция, не требующая выживания.

Положите крысу на правый бок так, чтобы левая бритая сторона была обращена вверх. Убедитесь, что он лежит на скамье ровно с вытянутой осанкой и не приседает, передние лапы касаются друг друга, а задние лапы касаются друг друга очень нежно. Пальпируйте почку, чтобы определить, где она естественным образом лежит в забрюшинном пространстве, и с помощью острия нарисуйте прямую линию, параллельную телу, с помощью пары зубных щипцов.

Возьмите кожу и используйте пару гемостатиков, чтобы сжать кожу вдоль нарисованной линии, чтобы раздавить ткань и предотвратить кровотечение с помощью хирургических ножниц. Разрежьте вдоль разреза. Используйте ту же процедуру для разрезания внешнего мышечного слоя, который при необходимости является тонким.

Используйте гемостатики для предотвращения кровотечения для разреза во внутреннем мышечном слое, который обнажит брюшину. Повторно пальпируйте почку, чтобы оценить размер. Зажмите линию разреза меньше почки, гарантируя, что разрез находится прямо над почкой.

Лучше всего сделать этот разрез слишком маленьким и при необходимости сделать его больше. Найдите почку и с помощью щипцов захватите окружающий жир, двигаясь к нижнему полюсу почки ладонью над ладонью. Как только нижний полюс почки будет достигнут, осторожно протяните почку через разрез, очень осторожно сжимая ниже почки, чтобы вывести ее наружу.

Если разрез слишком маленький, раздавите мышечный слой и разрежьте его, чтобы расширить его. Повторите процедуру экстериоризации почки после экстериоризации почки крысы и помещения крысы на предметный столик микроскопа для визуализации. Если ваш микроскоп оснащен моторизованным предметным столиком, способным отмечать местоположения с помощью двухпроходного флуоресцеинового стержня, доминного фильтра и маломощного объектива, найдите и центрируйте отдельные клубочки, которые будут выглядеть как пустые круглые структуры, окруженные проксимальными канальцами.

Наличие присущей ей желто-оранжевой автофлуоресценции для каждой локации, переключение турели на более мощную цель погружения в воду и получение 3D-данных для каждого клубочка. Убедитесь, что капиллярные петли и пространство Боумена хорошо видны. Использование псевдоцветовой палитры поможет визуализировать эти структуры.

Затем, сосредоточившись на поверхностном кровеносном сосуде, медленно вводите флуоресцентный альбумин, убедившись, что дано время для системного распределения молекул с низким коэффициентом клубочкового цинка или GSC, важно максимизировать значения интенсивности в плазме, но не достигать уровней, которые насытят фотодетекторы в микроскопе. Это повышает обнаруживаемость отфильтрованных молекул Подождав примерно 10 минут, чтобы любые потенциальные фрагменты с малой молекулярной массой очистились, получите трехмерные объемы с интервалом в один микрон для использования при расчете альбумина с помощью программного обеспечения для обработки изображений метаморфов. Загрузите наборы 3D-данных вместе с фоновыми изображениями для каждого клубочка в объеме, содержащем флуоресцентный альбумин.

Найдите поверхностную капиллярную петлю с достаточным пустым пространством между ее определенными краями и краем капсулы Боумена. На заднем плане объем. Найдите ту же фокальную плоскость, которая должна содержать все визуальные признаки изображения, содержащего альбумин.

Выберите интересующую область в пределах интересующей вас капиллярной петли и обратите внимание на показания средней интенсивности. Затем выберите область в пространстве Боумена и обратите внимание на среднее значение интенсивности. Они будут использоваться в качестве фоновых значений для количественной оценки.

Выберите аналогичную область в пространстве Боумена на изображении, содержащем альбумин. Проделайте это по крайней мере для двух других областей, чтобы получить значение средней интенсивности в пространстве Боумана. Выберите капиллярную петлю с самой яркой интенсивностью плазмы и нарисуйте область вокруг нее.

Затем, используя функцию порога, выделите яркие значения в циркулирующей плазме, избегая темных полос, которые являются циркулирующими эритроцитами. Обратите внимание на средние значения интенсивности выбранного пространства плазмы. Важно отдавать предпочтение светлым областям плазмы, потому что факторы в крови могут привести только к недооценке уровня флуоресценции плазмы.

Введите значения в таблицу Excel, чтобы рассчитать GSC, где GSC равен разнице необработанного пространства лучника. Интенсивность минус фон Интенсивность пространства Боумена деленная на разность интенсивности необработанной капиллярной петли минус фоновая интенсивность капиллярной петли. Поглощение отфильтрованного флуоресцентного альбумина происходит преимущественно в раннем сегменте проксимальных канальцев.

S-образный, эта панель показывает поперечное сечение клубочка и S-одного, взятого у мюнхенской крысы-суфлера Wistar, примерно через 20 минут после инфузии первоначального коллоса техасского красного RSA. Открытие пространства Боумена и жадное поглощение альбумина красным цветом показано в сегменте S one. На этой панели показана неглубокая 3D-проекция того же набора данных размером 20 микрон, а здесь показана проекция с меньшей мощностью, сделанная примерно через 60 минут после инфузии.

Эти изображения демонстрируют, что внутривитальная микроскопия может позволить визуализировать судьбу введенного материала после фильтрации, подтверждая в некоторой степени наблюдаемый здесь коэффициент фильтрации, показанный здесь, является изображениями, полученными с поверхности клубочка. Эта панель является фоновым изображением, и это изображение было сделано примерно через 12 минут после инфузии сывороточного альбумина техасской красной крысы. Эти две панели нарисованы в псевдоцвете.

Три небольшие области интереса, нарисованные в пространстве Боумана, используются для расчета средней интенсивности флуоресцентного альбумина, который переместился через фильтрационный барьер. Средние значения интенсивности для отдельных регионов были представлены в выделенной области в диалоговом окне «Показать статистику региона». Значение GSC для альбумина 0,0111, полученное для этого отдельного клубочка, находится в пределах диапазона у этой линии мюнхенских звездных крыс в состоянии кормления.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественный и качественный анализ других почечных структур, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как возможный транспорт макромолекулы после фильтрации в мочевое пространство после ее развития. Этот метод позволил исследователям в области физиологии почек исследовать динамические физиологические и патофизиологические процессы не один раз, а в продольном направлении. Со временем так и стало.