Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации транскрипционных регуляторов любого гена, представляющего интерес, с помощью простого протокола трансфекции с высокой пропускной способностью и домашнего анализа люциферазы двойного свечения. Это достигается путем разработки и клонирования уникального набора двойных репортерных плазмид люциферазы. Эти плазмиды трансфицируются в 2 9 3 Т-клетки в микропланшетах с плазмидами из библиотеки экспрессии ДНК, так что каждая лунка трансфицируется одной библиотечной плазмидой.

Через 48 часов проводится анализ активности люциферазы светлячков, а затем проводится анализ активности ванильлюциферазы. Заключительным этапом является расчет соотношения активности светлячков и ванильной люциферазы. В конечном счете, относительная индукция интересующего гена в ответ на каждую библиотеку.

Ген выводится по соотношению активности светлячка и ванильлюциферазы в каждой лунке после нормализации на основе планшетов. Основным преимуществом этой методики перед существующими протоколами репортерного анализа является ее способность быстро генерировать функциональные данные для большого количества генов с минимальными трудозатратами и затратами. За сутки до трансфекции, обозначенные как первый день скрининга, 2 9 3 Т-клеток помещаются в 96.

Ячейки луночных планшетов подбирают по размеру, подсчитывают и ресуспендируют до концентрации 1,5 умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр. В DMEM, содержащем 14% FBS, вылейте клетки в стерильный резервуар. Поместите резервуар с шестью чистым дном, 96 луночными планшетами и коробкой с наконечниками для фильтрующих пипеток на роботизированную палубу автоматизированного манипулятора для работы с жидкостями.

Для каждой библиотечной пластины, подлежащей экранированию, должны быть установлены две пластины с ячейками. Выдайте по 100 микролитров клеток в каждую лунку каждой пластины с плотностью от 1,5 до 10 до четвертой ячейки на лунку. В ходе этой демонстрации будут показаны три библиотечные пластинки.

Следовательно, подготавливают шесть пластин ячеек, центрифугируют клеточные пластины при 50-кратной перегрузке в течение двух минут, используя низкие скорости нарастания, чтобы обеспечить одинаковую плотность ячеек в каждой лунке. На этом изображении показано, как должны выглядеть пластинчатые клетки после центрифугирования. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа в течение ночи.

Чтобы приготовить плазмиды светлячка и ванильного репортера, разведите каждую до пяти нанограммов на микролитр в воде, свободной от эндотоксина, в конической пробирке объемом 15 миллилитров. Соедините разведения в соотношении пять на три светлячка к ванильной плазмиде по объему. Пипетку комбинированных плазмид в каждую лунку 96-луночного планшета, дозируя 17 микролитров на библиотечную пластину, плюс от двух до 10 микролитров избытка в каждую лунку, клетки трансфицируют на второй день скрининга.

Чтобы начать эту процедуру, для каждой библиотечной пластины смешайте 107,5 микролитров жидкости комнатной температуры или дефекта с 4,3 мл сыворотки, разведите от одного до 40 в полистирольной пробирке, инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, дозируйте 44 микролитра на библиотечную пластину в каждую лунку 96-луночной полистирольной пластины с V-образным дном. Поместите библиотечную пластину ДНК, пластину с разбавленным эффектом опта, репортерную плазмидную пластину и коробку с наконечниками для пипеток на аспират роботизированной деки. 17 микролитров репортерных плазмид, 43 микролитра разбавленного опт-эффекта и 26 микролитров библиотечной ДНК с добавлением воздушного зазора в пять микролитров между каждой аспирацией.

Библиотечную ДНК следует аспирировать в последнюю очередь, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Выложите содержимое наконечников в новую крышку из полистирола с дном и отставьте на 20 минут, чтобы образовались комплексы липидной ДНК. При пересечении нескольких библиотечных планшетов замените наконечники для пипеток и библиотечную пластину и повторите через 20 минут, откройте пластину для смеси ДНК с эффектом опта и поместите ее на роботизированную деку с двумя планшетами по 2 9 3 Т-клеток с помощью одной коробки наконечников для пипеток.

Аспирируйте 80 микролитров смеси ДНК с эффектом опт и медленно дозируйте 40 микролитров на лунку для каждой пластины клеток. Покройте клетки после того, как к клеткам во всех планшетах будет добавлена смесь ДНК. Центрифугируйте планшеты при 1, 200 умноженных на G в течение 30 минут.

Верните планшеты в инкубатор и инкубируйте клетки в течение четырех-шести часов. Во время этой инкубации приготовьте свежую среду, смешав 12 миллилитров DMEM, содержащих 10% FBS, и 10 микрограммов ципрофлоксина на миллилитр. Для каждой трансфицированной библиотечной пластины насыпьте свежие среды в стерильный резервуар.

Затем поместите на деку робота две коробки с наконечниками для роботов, одну пластину с ячейками, резервуар со свежей средой и резервуар для отходов. Затем отсасывайте 100 микролитров среды из ячеек и дозируйте в резервуар для отходов, частично заполненный на 70% этанолом. С помощью свежих типсов отсасывают 100 микролитров свежей среды и медленно дозируют на клетки.

Верните тарелки в инкубатор на 48 часов. Проводятся анализы светлячка и ванильной люциферазы. Через 48 часов после трансфикации на четвертый день скрининга для каждой библиотечной пластины приготовьте восемь миллилитров трех пробирных буферов для анализа Firefly и 12 миллилитров трех буферов для ванильного анализа из соответствующих исходных растворов, распределите по 82 микролитра пробирного буфера для анализа Firefly в каждую лунку 96-луночного V-образного планшета для каждой анализируемой библиотечной пластины.

Аналогичным образом налейте 122 микролитра ванильного буфера в каждую лунку другой 96-луночной V-образной пластины. Для каждой проверяемой пластины отложите оба буфера для анализа. Поместите коробку с наконечниками для пипеток, резервуар для отходов и две пластины с ячейками, трансфицированными из той же библиотечной пластины, на деку робота, отасуньте 60 микролитров среды с каждой пластины и выбросьте в резервуар для отходов, частично заполненный крышками из 70% этанола, и отложите в сторону.

Рядом поместите две коробки с наконечниками для пипетки. Пластина из трех пробирных буферов для анализа светлячков и набор клеточных планшетов на деке робота. Асассируйте 40 микролитров трех х файрфлай пробного буфера и добавьте его в первую пластину клеток, тщательно перемешав.

Переход на новые наконечники для пипеток. Повторите то же самое для второй клеточной пластины. Поместите клетки при комнатной температуре на 10 минут для полного лизиса.

Запишите люминесценцию из каждой лунки каждой клеточной пластины на люминометре в течение одной секунды на лунку. Возврат пластин на деку робота. Поместите две коробки с наконечниками для пипеток, планшет с тремя буферами для анализа и набор клеточных планшетов на деку робота.

Отаспирируйте 60 микролитров из трех ванильных проб буфера и добавьте его в первую пластинку клеток. Тщательно перемешиваем. Переход на новую коробку с наконечниками для пипеток.

Повторите то же самое для второй клеточной пластины. Запишите люминесценцию со всех пластин на люминометрик. Записываем каждую лунку в течение одной секунды.

Типичные значения люциферазы для одной половины планшета приведены в этих таблицах. Коэффициент люминесценции светлячка к возобновлению или коэффициент F два R для каждой скважины рассчитывается путем деления количества сигнала светлячка на количество пропущенных сигналов возобновления, и результаты показаны на панели C. На панели D показано значение индукции для каждой скважины, рассчитанное путем деления коэффициента F два R скважины на среднее отношение F два R пластины, без учета самых высоких и нижних 25% скважин. Значения индукции должны быть усреднены по репликациям для одной трансфицированной библиотечной пластины.

А гены, индуцирующие или подавляющие альфа-синуклеин более чем в три раза, считаются хитами. Обратите внимание, что индуктор с 32 кратами в скважине H two в этом репрезентативном результате, показанном здесь, является графическим представлением значений индукции для одиночной пластины, где лунка H two выделена синим цветом. Hi.H 2 является нейронным фактором транскрипции, ранее не связанным с экспрессией альфа-синуклеина.

Важно убедиться в том, что скрининг проводится в пределах линейного диапазона репортерных анализов, чтобы клоны, вызывающие повышенную экспрессию, были измерены по мере повышения активности люциферазы, с этой целью клетки были трансфицированы увеличивающимся количеством плазмид светлячка и ванилилюциферазы под контролем сильного промотора H-C-M-V-I-E одного промотора и анализа. С помощью этого протокола было замечено, что активность светлячков остается линейной в широком диапазоне значений. В то время как кривая активности ванили выравнивается выше 15 нанограммов на лунку.

Также важно проводить анализы сразу после этапа инкубации, чтобы избежать нелинейности из-за истощения субстрата. Временной ход сигнала распада для анализа люциферазы светлячков показал значительную активность люциферазы светлячков в течение одного часа после добавления реагентов с использованием этого протокола, 7 670 человеческих генов были проверены и 68 новых регуляторов альфа-синуклеина были в конечном итоге идентифицированы в репрезентативных результатах, показанных здесь. Каждая горизонтальная линия представляет коэффициент индукции одного пораженного гена по сравнению с контролируемым нейтральным индуктором GFP.

Синие линии представляют положительные индукторы, в то время как единственная красная линия представляет супрессор, значения индукции рассчитываются как отношение промотора альфа-синуклеина, управляющего активностью люциферазы светлячка, к промотору ЦМВ, управляющим активностью люциферазы каждого удара, нормализовано к тому же анализу люциферазных конструкций с использованием индуктора GFP. После этой процедуры. Другие методы, такие как количественная ПЦР в сочетании с дальнейшими анализами сверхэкспрессии и нокдауна, могут быть выполнены для того, чтобы гарантировать, что идентифицированные попадания регулируют эндогенную мишень.