V3 Без пятен рабочий процесс для практического, удобного и надежного тотального контроля загрузки белка в Западном Blotting

BioRad V three Workflow обеспечивает исследователям более надежную количественную оценку и уверенность в процессе вестерн-блоттинга. Это достигается путем использования гелей без пятен TGX для разделения и визуализации образцов белка. После разделения белки переносятся на мембрану с помощью системы турбо-быстрого переноса блоттинга, которая позволяет проверить качество и эффективность переноса.

После проверки переноса мембрану блокируют и зондируют первичными и вторичными антителами к белкам-мишеням. Наконец, целевые уровни белка нормализуются с использованием измерения общего белка без пятен в качестве контроля нагрузки. Рабочий процесс V 3 обеспечивает удобство и прозрачность процесса вестерн-блоттинга, обеспечивая исследователям уверенность на каждом этапе от разделения до переноса и количественного определения.

Основное преимущество рабочего процесса V three Western по сравнению с традиционным вестерн-блоттингом заключается в том, что технология без пятен обеспечивает практичный, удобный и надежный контроль общей загрузки белка для нормализации целевых белковых сигналов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с надежностью методологий контроля нагрузки для западного метода блоттинга, которые включают перенасыщение сигналов бытовых белков и дифференциальные уровни экспрессии хозяйственных белков в различных экспериментальных условиях. Мы обнаружили, что белки, активированные в гелях без пятен, также могут быть визуализированы на цветах без дальнейшего окрашивания, что позволяет использовать их в качестве альтернативы обычным пятнам от общего белка, а также для контроля загрузки белка.

В ближайшие несколько минут мы продемонстрируем полный рабочий процесс V 3 с использованием мультиплексной флуоресценции. Эта же процедура может быть использована и для хемилюминесценции после подготовки образцов белка в соответствии с текстовым протоколом. Используя критерий TGX для удаления пятен от любого сборного геля KD, снимите расческу и ленту со дна кассеты.

Поместите кассету в гелевый аппарат и заполните оба резервуара ходовыми буферами. Загрузите стандарты белка и образцы. Затем запустите гель в течение 20 минут при напряжении 300 вольт.

После завершения электрофореза используйте инструмент для открытия гелевой кассеты на крышке Criterion Cell, чтобы открыть кассету. Затем нанесите несколько миллилитров воды на УФ-транслюминатор тепловизора Chemi Dock MP. Осторожно извлеките гель из кассеты и поместите его в программное обеспечение UV Trans Illuminator Запустите Image Lab и настройте новый одноканальный протокол для гелей без пятен, используя время активации геля по умолчанию в одну минуту, выберите подходящий тип геля и автоматическую оптимизацию по умолчанию для интенсивных полос.

Затем нажмите «Запустить протокол». После завершения съемки визуализируйте разделение и качество образца. Затем сразу приступайте к этапу переноса.

Чтобы осуществить перенос белка, откройте пакет для переноса транс блока turbo MIDI PVDF. Поместите нижний стек в центр основания кассеты. Удалите гель из тепловизора.

Выровняйте гель поверх мембраны. Аккуратно используйте валик для блота, чтобы удалить пузырьки воздуха между гелем и мембраной. Далее выровняйте верхний стек поверх геля.

Удалив пузырьки воздуха, поместите крышку кассеты на основание. Сильно нажмите на крышку, поверните диск по часовой стрелке, чтобы зафиксировать, и вставьте кассету в один из двух отсеков для промокательной бумаги. На главном экране выберите протокол турбо.

Выберите два мини геля или один мини гель и нажмите кнопку запуска для соответствующего отсека. Перевод будет завершен за семь минут. Извлеките кассету из отсека.

Разблокируйте кассету и разберите промокательный бутерброд. Поместите гель для посттрансфера на УФ-транслюминатор тепловизора Chemi Dock MP и немедленно поместите мембрану в деионизированную воду. Настройте новый одноканальный протокол для гелей без пятен без времени активации.

Выберите подходящий тип геля и вручную установите время воздействия на время предварительного переноса геля и нажмите «Запустить протокол». Как только съемка изображения будет завершена. Проверьте эффективность переноса, сравнив интенсивность полосы отбора проб между гелями до и после переноса.

Извлеките гель из лотка для образцов, так как он больше не нужен, и выбросьте. Для проверки переложите на блот. Поместите мембрану на лоток для образцов и настройте новый протокол для одного канала.

Для удаления пятен промокните. Выберите подходящий тип геля и автоматическую оптимизацию по умолчанию для интенсивных полос. Затем нажмите «Запустить протокол».

После завершения захвата изображения проверьте передачу на мембрану. Снимите блот-мембрану с УФ-транс-осветителя и поместите ее в блокирующий буфер для вестерн-блоттинга. После инкубации мембраны при комнатной температуре в течение одного часа инкубируйте ее с первичными антителами мышей и кроликов в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Вылейте раствор антитела и используйте 50 миллилитров TBST для промывания кляксы в течение пяти минут. Инкубируйте блот с флуоресцентными конъюгированными, вторичными антителами против музы и против кролика в течение одного часа при комнатной температуре. Затем с помощью TBST промойте кляксу пять раз по пять минут каждый.

Чтобы получить изображение блота, поместите его на УФ-транс-осветитель имидж-сканера Chemi doc MP в программном обеспечении Image Lab. Настройте новый многоканальный протокол. Настройте первый канал, выбрав dite six 50 в разделе «Блоттинг», и используйте автоматическую оптимизацию по умолчанию для интенсивных полос.

Повторите эти шаги, чтобы настроить второй и третий каналы для DITE 5, 49 и блоттинга без пятен соответственно. Выберите подходящий тип геля и нажмите кнопку «Запустить протокол». Чтобы определить полосы движения, выберите полосу и полосы изображения без пятен.

Затем автоматический поиск полосы движения для точного количественного определения. Убедитесь, что профили фона на каждой полосе образца одинаковы, отрегулировав размер роликового диска до 70. Подтвердите однородность фона путем сканирования всех профилей полос движения для определения полос в обоих каналах dite six 50 и 5 49.

Используйте инструмент поиска полос для обнаружения полос с использованием настроек чувствительности по умолчанию. Чтобы назначить канал нормализации, вернитесь на панель инструментов анализа. Нажмите кнопку нормализации и выберите блот без пятен, убедившись, что выбран общий белок дорожки.

Чтобы назначить стандартные полосы молекулярной массы, вернитесь к панели инструментов анализа, нажмите Инструменты анализа MW и установите флажок под соответствующей полосой. Наконец, чтобы просмотреть нормализованную интенсивность полосы белка, нажмите на таблицу анализа на панели инструментов. Программное обеспечение автоматически сгенерирует таблицу, содержащую интенсивность объема, коэффициенты нормализации и нормализованные объемы.

Нормализованные объемы следует использовать для анализа данных и составления отчетности. Таблицу можно экспортировать. Для дальнейшего анализа мы продемонстрировали полный рабочий процесс вестерн-блоттинга V three.

Сейчас мы покажем вам репрезентативные результаты реального эксперимента. Лизаты клеточных культур контрольных и облученных лимфобластов анализировали с помощью рабочего процесса V трех вестерн-блоттингов. Сигнал общего белка без пятен отображается синим цветом.

Целевой белок M CM семь показан красным цветом, а подтвержденный контроль загрузки белка GA DH показан зеленым цветом. GA DH был проверен в качестве подходящего средства управления нагрузкой путем оценки его линейности с использованием экспериментальных условий, описанных в этом видео. Сигналы общего белка без пятен для каждой полосы на блоттинге были измерены с помощью программного обеспечения для лаборатории изображений.

Интенсивность семи сигналов MCM была нормализована с использованием как общего белка, так и сигналов GA DH. Семь объемов полос белка MCM, нормализованных обоими методами, показали снижение уровня экспрессии на 25% в облученных образцах по сравнению с контрольными образцами до точной нормализации. Домашний белок требует валидации, подтверждающей его линейный диапазон и постоянные уровни экспрессии среди образцов без валидации.

Контроль загрузки белка в домашних условиях не гарантирует точной нормализации. Напротив, нормализация общего белка не требует валидации. Таким образом, сигнал общего белка без пятен, полученный в результате рабочего процесса V-3, обеспечивает практический, удобный и более надежный контроль нагрузки при попытке выполнения этой процедуры.

Помните, что технология без пятен позволяет флуоресцентную визуализацию образцов белка с помощью УФ-индуцированной ковалентной модификации доступных остатков триптофана. Лишь в редких случаях эта модификация существенно повлияет на последующие приложения, такие как иммунодетекция или масс-спектрометрия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять рабочий процесс по вестерну V три и нормализацию общего белка без пятен.

Несмотря на то, что мы продемонстрировали этот рабочий процесс для мультиплексного флуоресцентного вестерн-блоттинга, технология без пятен также может быть использована для нормализации общего белка с помощью люминесцентных вестерн-блоттингов.