Долгосрочная Хронический Синегнойной палочки Дыхательных инфекции у мышей

Общая цель этой процедуры заключается в установлении стойкой хронической инфекции дыхательных путей Pseudomonas aeromonas у мышей. Это достигается путем предварительного культивирования выбранного штамма бактерий Pseudomonas aerogen. Второй шаг заключается в встраивании бактерий в небольшие шарики агара путем смешивания бактерий с агаром и минеральным маслом при температуре 50 градусов Цельсия, а затем охлаждения смеси до четырех градусов Цельсия при медленном непрерывном перемешивании.

Затем минеральное масло удаляется несколькими промывками с помощью PBS, и аликвота из шариков агара гомогенируется и наносится на агаровые пластины. Чтобы определить содержание бактерий, заключительным этапом является введение нескольких микролитров суспензии агаровых бусин в трахею мышей, чтобы установить хроническую инфекцию легких Pseudomonas aerogen. В конечном счете, жидкость бронхоальвеолярного лаважа и легкие могут быть восстановлены в разные моменты времени после заражения и нанесены на агаровые пластины для определения процента хронически инфицированных мышей и бактериальной нагрузки в воздухе выживших мышей. Основное преимущество этих методов по сравнению с существующими методами заключается в том, что они позволяют протекать стабильно долгосрочно хронической инфекции у большого процента мышей, что приводит к сохранению стабильной бактериальной нагрузки до одного месяца.

Методы AGA bit обеспечивают в легких мыши микроаэробные условия, которые позволяют бактериям расти в виде микроколоний. Подобно росту слизи у пациентов с муковисцидозом, эти методы могут помочь исследователям в решении ключевого вопроса патогенеза муковисцидоза и других респираторных заболеваний, а также в тестировании новых методов лечения против хронической легочной инфекции Pseudomona sgin. Методы также могут быть использованы для достижения хронической инфекции другими патогенами, включая коинфекцию UO Apache или Staphylococcus Iris с различными патогенами или конкуренцию Также возможны эксперименты, демонстрирующие процедуру либо фено, либо постдока, и Камил Рива, аспирант в моей лаборатории За три дня до мышиного испытания, инокулировать петлю, полную Pseudomonas с массированной культурой при температуре минус 80 градусов по Цельсию, на тарелку с соевым агаром и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день. Выберите одну колонию, инокулированную в пять миллилитров соевого бульона и инкубированную при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи в трясущемся инкубаторе при 200 оборотах в минуту, на следующее утро разбавьте небольшую аликвоту бактериальной культуры в фосфатно-солевом буфере в солевом буфере от одного до 50. Затем измерьте оптическую плотность на уровне 600 нанометров.

Затем разбавьте ночную бактериальную культуру, добавив два OD бактериальной суспензии в новую пробирку, содержащую 20 миллилитров свежего TSB, инкубированного при 37 градусах Цельсия в течение примерно трех-четырех часов, до логарифмической фазы в встряхивающем инкубаторе при 200 оборотах в минуту до тех пор, пока не будет достигнуто в общей сложности от 10 до 50 OD. Как только Pseudomonas aerosa достигнет логарифмической фазы, соберите бактериальные клетки центрифугированием при температуре 2700 раз под действием силы тяжести в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Затем.

Ресуспендируйте бактериальную гранулу в одном миллилитре стерильного PBS и тщательно перебейте ее в вихрь для полной суспензии. Затем смешайте один миллилитр бактериальной суспензии с девятью миллилитрами жидкой ТСА, предварительно уравновешенной до 50 градусов Цельсия. Добавьте эту смесь в подогретое до 50 градусов Цельсия тяжелое минеральное масло.

Сразу же помешиваем в течение шести минут при комнатной температуре. При перемешивании в масле должен образоваться видимый вихрь. Впоследствии остудите смесь до четырех градусов Цельсия, помешивая на минимальной скорости в течение 35 минут.

Затем отдохните в льду еще 20 минут. После этого переложите шарики агара в 50-миллилитровые пробирки и центрифугируйте 2 700 раз. Сила тяжести в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Аккуратно удалите минеральное масло и промойте шарики агара гранулами со стерильным ПБС. Повторите процедуру шесть раз после трех мытья. Шарики можно гранулировать под действием силы тяжести, а не с помощью центрифуги после последней стирки.

Ресуспендируйте агаровые шарики в 20-30 миллилитров PBS, асептически гомогенизированных 0,5 миллилитров шариков. Далее разведите 100 микролитров гомогенизированных шариков в 900 микролитрах стерильного PBS и серийно. Разбавьте бусины в шесть раз, уменьшив до 10 до минус шестой в соотношении один к 10.

Затем пластины серийного разведения на пластинах TSA в том числе в неразбавленном виде. Уменьшите пробу до 10 до минус шестой и инкубируйте планшеты при 37 градусах Цельсия. Измерьте диаметр шарика с помощью микроскопа с инвертированным светом на нескольких полях.

Диаметр бусины должен составлять от 100 до 200 микрон перед испытанием мышей. Подсчитайте количество колониеобразующих единиц на планшетах TSA, чтобы определить количество КОЕ на миллилитр в агаровой суспензии. Затем отрегулируйте объем шариков агара до двух-четырех умножить на 10 до седьмого КОЕ на миллилитр, чтобы достичь оптимального инокулюма от одного-двух умножить на 10 до шестой в 50 микролитров.

Поместите шести-восьминедельного самца мыши, ранее получившего анестезию кетамином и ксилазином, в положение лежа на грелке, продезинфицируйте его шерсть 70% этанолом. Обнажите трахею вертикальным разрезом кожи. Затем с помощью пинцета отделите мышцы, покрывающие трахею.

Затем берут до 50 микролитров суспензии агаровых шариков на один миллилитр шприца. После этого интубируют трахею с помощью катетера и прикрепляют к катетеру одномиллилитровый шприц с агаровой суспензией. Осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы позволить шарикам имплантироваться в легкое.

Затем закройте разрез с помощью шовных зажимов. На этом шаге. Поместите усыпленную мышь в положение лежа на спине и продезинфицируйте ее шерсть 70% этанолом.

Далее обнажите трахею и грудную клетку вертикальным разрезом кожи. После этого обнажают легкие, разрезав диафрагму. Вставьте под трахею шовную нить с помощью пинцета и интубируйте трахею с помощью катетера.

Затем потяните за два конца шовной нити, чтобы привязать катетер к трахее, а не к нити вокруг трахеи. Теперь возьмите один миллилитр среды для культивирования клеток с помощью одномиллилитрового шприца и прикрепите его к катетеру. Нажмите на поршень шприца, чтобы промыть легкие, немедленно восстановить жидкость и хранить ее в 15-миллилитровой пробирке.

Повторите этот шаг три раза с общим количеством трех миллилитров среды, а затем храните жидкость бронхоальвеолярного лаважа на льду для сбора и анализа легких. Вырежьте легкие у мыши. Промойте их в стерильном PBS.

Затем отделите доли. Положите их в пробирку с круглым дном с двумя миллилитрами стерильного PBS и храните на льду. Асептически гомогенизировать легкие и серийно.

Разведите гомогенат в PBS в соотношении один к 10. Затем планшеты серийно разбавляют, включая неразбавленный образец на планшетах TSA, и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Возьмите жидкость BAL изо льда и промокните ее раствором турка в соотношении один к двум под оптическим микроскопом с инвертированным светом.

Подсчитайте общее количество клеток в камере для подсчета дифференциального количества клеток: центрифугируйте жидкость BAL при 330-кратном давлении в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия. Далее отбраковывают надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр в клеточной культуральной среде, содержащей 10% места фетальной бычьей сыворотки. Микроскоп стекает и фильтрует в соответствующие пазы в спине цитоспина так, чтобы картонные фильтры были обращены к его центру.

Пипеткой по 150 микролитров каждого образца в соответствующие лунки цитозина и центрифузия цитоцентрифуги при 300-кратном течении силы тяжести в течение пяти минут. Затем следует наблюдать пятно клеток, после окрашивания пятна дифференциальный подсчет может быть выполнен под микроскопом. На этом рисунке показано время течения хронической инфекции Pseudomonas aerogen референсным штаммом PA oh one и RP 73.

Клиническое напряжение для каждой временной точки. Гистограммы показывают процент смертности, вызванной бактериемией, красным цветом и выживаемость серым, или процент животных, которые избавились от инфекции, белым цветом, и тех, у кого была обнаружена хроническая инфекция, зеленым. Клинический штамм Pseudomonas aerogen RP 73 более эффективен в установлении хронической инфекции по сравнению с лабораторным штаммом PA oh one.

Выживших мышей усыпляли в указанные моменты времени, а легкие собирали, гомогенировали и культивировали на планшетах TSA для определения бактериальной нагрузки. Кривые роста штаммов P oh one и RP 73 в легких мышей показывают, что количество бактерий через три дня после заражения выше для P oh one по сравнению с RP 73. Затем, начиная с 7 дней после установления хронической инфекции, бактериальная нагрузка стабилизируется на уровне от 10 до четвертого и от 10 до пятого КОЕ на легкое для обоих штаммов, после семи дней хронической инфекции клиническим штаммом RP 73 оценивали рекрутирование воспалительных клеток в жидкости BAL.

Количество общих лейкоцитов значительно выше у инфицированных мышей RP 73 по сравнению с неинфицированными мышами. Наиболее представленными клетками являются нейтрофилы, свидетельствующие о значительной реакции врожденной иммунной системы на хроническую инфекцию. В рамке ниже стрелки указывают на нейтрофилы и макрофаг, видимые в пятне на предметном стекле после спина цито.

Показано окрашивание гематина и эозина на гистологических срезах легких мышей после семи дней хронической инфекции rp. 73 Клинические бусины штамма, обозначенные стрелками, могут наблюдаться в просвете бронхов и микроколониях бактериальных клеток. В инфицированных зонах бронхи и легочная паренхима характеризуются массивным воспалительным набором клеток.

В то время как дыхательные пути неинфицированной мыши были свободны от воспалительных клеток, диаметр и конечная концентрация BES являются очень важными деталями. Чтобы добиться хорошего результата, важно помнить, что на размер может влиять скорость вращения во время фазы охлаждения, и что начальное количество бактерий может повлиять на окончательное разбавление шариков. Более того, выбор соответствующего штамма Pseudomona, который вызывает низкую смертность мышей и высокий процент хронической инфекции, позволит свести к минимуму количество используемых мышей.

После заражения мышей проводится бактериальный подсчет. Кроме того, воспалительная реакция с точки зрения общего и дифференциального количества клеток На уровне ВИР бронхов может быть проведен анализ цитокинов жидкости, анализ мелопероксидазы и гистологический анализ с целью изучения язвенной реакции на бактериальную инфекцию. Не забывайте, что работа с условно-патогенными микроорганизмами, такими как синегнойные палочки, может привести к появлению бороды, и необходимо всегда принимать соответствующие меры, такие как ношение перчаток, работа с бактериями под шкафом биобезопасности и использование стерильных методов.

Разработка соответствующих животных моделей позволила провести доклинические испытания новых антибактериальных и противовоспалительных молекул. Это важный шаг для будущих терапевтических вмешательств при инфекции легких у пациентов с муковисцидозом или другими респираторными заболеваниями.