Долгосрочная Хронический

Общая цель данной процедуры заключается в создании стойкой долгосрочной хронической инфекции дыхательных путей у мышей, вызванной Pseudomonas aerogen. Это достигается путем первоначального культивирования выбранного штамма бактерий Pseudomonas aerogen. На втором этапе бактерии заключают в небольшие агаровые гранулы, смешивая их с агаром и минеральным маслом при 50 °C с последующим охлаждением смеси до 4 °C при медленном непрерывном перемешивании.

Затем минеральное масло удаляют путем нескольких промывок раствором PBS, после чего аликвоту агаровых гранул гомогенизируют и высевают на агаровые пластины. Для определения бактериального содержания на заключительном этапе вводят несколько микролитров суспензии агаровых гранул в трахею мышей для создания хронической легочной инфекции, вызванной Pseudomonas aerogen. В конечном итоге, в разные моменты времени после заражения можно собрать бронхоальвеолярный лаваж и легкие, которые затем высевают на агаровые пластины для определения процента хронически инфицированных мышей и бактериальной нагрузки в дыхательных путях выживших животных. Основным преимуществом метода с использованием агаровых гранул по сравнению с существующими методами является возможность создания стабильной долгосрочной хронической инфекции у высокого процента мышей, что обеспечивает сохранение стабильной бактериальной нагрузки на срок до одного месяца.

Методы с использованием агаровых бусинок (AGA) создают в легких мыши микроаэробные условия, которые позволяют бактериям расти в виде микроколоний. Подобно росту в слизи пациентов с муковисцидозом, эти методы могут помочь исследователям в решении ключевых вопросов патогенеза муковисцидоза и других респираторных заболеваний, а также в тестировании новых методов терапии против хронической легочной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Данные методы также могут быть использованы для достижения хронической инфекции другими патогенами, включая Burkholderia cenocepacia или Staphylococcus aureus, коинфицирования различными патогенами или проведения экспериментов по конкуренции. Процедуру демонстрируют Фено, постдок, и Камиль Рива, аспирант моей лаборатории. За три дня до заражения мышей инокулируйте петлей Pseudomonas aeruginosa из стоковой культуры, хранящейся при -80 °C, на чашку с соево-казеиновым агаром (TSA) и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.

На следующий день. Выберите отдельную колонию, инокулированную в 5 мл соево-казеинового бульона (tryptic soy broth), и инкубируйте её при 37 °C в течение ночи в шейкере при 200 RPM. Следующим утром разведите небольшую аликвоту ночной культуры бактерий в фосфатно-солевом буферном раствое в соотношении 1:50. Затем измерьте оптическую плотность при 600 нм.

Затем разбавьте бактериальную культуру ночного культивирования, добавив две единицы OD (оптической плотности) бактериальной суспензии в новую пробирку, содержащую 20 миллилитров свежего бульона TSB, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно трех-четырех часов до достижения логарифмической фазы роста в шейкере при 200 об/мин, пока общая оптическая плотность не достигнет 10–50 OD. Как только *Pseudomonas aeruginosa* достигнет логарифмической фазы, соберите бактериальные клетки путем центрифугирования при 2 700 g в течение 15 минут при температуре 4 градусов Цельсия и удалите супернатант. После этого.

Ресуспендируйте бактериальный осадок в одном миллилитре стерильного PBS и тщательно перемешайте на вортексе до полного восстановления суспензии. Затем смешайте один миллилитр бактериальной суспензии с девятью миллилитрами жидкой среды TSA, предварительно доведенной до 50 °C. Добавьте полученную смесь в предварительно нагретый до 50 °C тяжелый минеральный olej.

Сразу же перемешивайте в течение шести минут при комнатной температуре. Перемешивание должно создавать видимую воронку в масле. Затем охладите смесь до 4 °C, перемешивая на минимальной скорости в течение 35 минут.

Затем выдержите на льду еще 20 минут. После этого перенесите агарозные бусины в пробирки Falcon объемом 50 мл и центрифугируйте при 2 700 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C.

Аккуратно удалите минеральное масло и промойте осадок из агаровых бусин стерильным PBS. Повторите процедуру шесть раз после трех промывок. После последней промывки бусины можно осадить под действием силы тяжести вместо использования центрифуги.

Асептически ресуспендируйте агаровые бусины в 20–30 мл PBS и гомогенизируйте 0,5 мл суспензии бусин. Затем разведите 100 мкл гомогенизированных бусин в 900 мкл стерильного PBS и выполните серию разведений. Проведите шестикратное серийное разведение бусин в соотношении 1:10 до достижения концентрации 10⁻⁶.

Затем высейте серийные разведения, включая неразведенный образец, на чашки с TSA. Выполните разведения образца до 10⁻⁶ и инкубируйте чашки при 37 °C. Измерьте диаметр гранул с помощью инвертированного светового микроскопа в нескольких полях зрения.

Диаметр гранул перед заражением мышей должен составлять от 100 до 200 микрон. Подсчитайте количество колониеобразующих единиц на чашках с TSA, чтобы определить число CFU на миллилитр в суспензии агаровых гранул. Затем доведите концентрацию агаровых гранул до 2–4 × 10⁷ CFU/мл, чтобы получить оптимальный инокулят в размере 1–2 × 10⁶ в 50 µL.

Поместите самца мыши в возрасте от шести до восьми недель, предварительно анестезированного кетамином и ксилазином, в положение на спине на греющую подушку, продезинфицируйте шерсть 70% ethanol. Обнажите трахею, сделав вертикальный разрез кожи. Затем с помощью пинцета разведите мышцы, закрывающие трахею.

Затем наберите до 50 µL суспензии агаровых бусин в шприц объемом 1 мл. После этого проведите интубацию трахеи катетером и подсоедините шприц объемом 1 мл с суспензией агаровых бусин к катетеру. Осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы ввести бусины в легкое.

Затем зашейте разрез с помощью хирургических скоб. На этом этапе поместите эвтаназированную мышь в положение на спине и продезинфицируйте шерсть 70% ethanol.

Затем обнажите трахею и грудную клетку, выполнив вертикальный разрез кожи. После этого обнажите легкие, разрезав диафрагму. С помощью пинцета введите под трахею шовную нить и проведите интубацию трахеи катетером.

Затем потяните за оба конца шовной нити, чтобы зафиксировать катетер у трахеи, стараясь не затягивать нить вокруг самой трахеи. Теперь с помощью шприца объемом 1 мл наберите 1 мл среды для культивирования клеток и подсоедините его к катетеру. Нажмите на поршень шприца, чтобы промыть легкие, затем немедленно соберите жидкость и поместите ее в пробирку объемом 15 мл.

Повторите этот шаг трижды, используя в общей сложности три миллилитра среды, после чего поместите бронхоальвеолярную лаважную жидкость на лед для последующего сбора и анализа легких. Извлеките легкие из организма мыши. Промойте их стерильным PBS.

Затем отделите доли. Поместите их в пробирку с круглым дном с 2 mL стерильного PBS и храните на льду. В асептических условиях гомогенизируйте легкие серийно.

Разбавьте гомогенат в PBS в соотношении 1:10. Затем высейте на чашки с TSA серийные разведения, включая неразбавленный образец, и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Достаньте жидкость БАЛ из льда и разбавьте ее раствором Тёрка в соотношении 1:2 под инвертированным световым оптическим микроскопом.

Для проведения дифференциального подсчета клеток определите общее количество клеток в камере Буркера. Центрифугируйте жидкость БАЛ с ускорением 330 ×g в течение восьми минут при температуре 4 °C. Затем удалите супернадант и ресуспендируйте осадок в культуральной среде с содержанием 10% фетальной бычьей сыворотки до концентрации 1 миллион клеток на мл. Поместите предметные стекла и фильтры в соответствующие слоты цитоцентрифуги, направив картонные фильтры к центру устройства.

Пипеткой перенесите по 150 µL каждого образца в соответствующие лунки цитоцентрифуги и центрифугируйте при 300 ×g в течение пяти минут. Затем следует визуально оценить слой клеток; после окрашивания мазка можно провести дифференциальный подсчет под микроскопом. На данном рисунке показана динамика хронической инфекции Pseudomonas aeruginosa с использованием эталонного штамма PAO1 и штамма RP73.

Клинический штамм для каждой временной точки. Гистограммы отображают процент смертности, вызванной бактериемией (красный цвет), и выживаемость (серый цвет), либо процент животных, у которых инфекция была полностью устранена (белый цвет), и тех, у которых развилась хроническая инфекция (зеленый цвет). Клинический штамм Pseudomonas aerogen RP 73 более эффективно вызывает развитие хронической инфекции по сравнению с лабораторным штаммом PA oh one.

Выживших мышей усыпляли в указанные моменты времени, после чего извлекали легкие, гомогенизировали и высевали на чашки с TSA для определения бактериальной нагрузки. Кривые роста штаммов P oh one и RP 73 в легких мышей показывают, что количество бактерий на третий день после инфицирования выше для P oh one по сравнению с RP 73. Затем, начиная с седьмого дня, при установлении хронической инфекции, бактериальная нагрузка стабилизируется на уровне от 10⁴ до 10⁵ КОЕ на одно легкое для обоих штаммов. После семи дней хронической инфекции клиническим штаммом RP 73 оценивали привлечение воспалительных клеток в жидкости БАЛ.

Общее количество лейкоцитов значительно выше у мышей, инфицированных RP 73, по сравнению с неинфицированными мышами. Наиболее представленными клетками являются нейтрофилы, что указывает на значительный ответ врожденной иммунной системы на хроническую инфекцию. В рамке ниже стрелки указывают на нейтрофилы и макрофаг, видимые в пятне на предметном стекле после цитоцентрифугирования.

Здесь представлено окрашивание гематилином и эозином гистологических срезов легких мыши через семь дней после хронического заражения клиническим штаммом rp. 73; стрелками показаны гранулы, которые можно наблюдать в просвете бронхов, и микроколонии бактериальных клеток. В инфицированных областях бронхи и легочная паренхима характеризуются массивным привлечением воспалительных клеток.

В то время как дыхательные пути неинфицированной мыши были очищены от воспалительных клеток, диаметр и конечная концентрация BES являются очень важными деталями. Для достижения хорошего результата важно помнить, что размер микросфер зависит от скорости перемешивания в фазе охлаждения, а исходное количество бактерий может повлиять на конечное разведение микросфер. Более того, выбор подходящего штамма Pseudomonas, вызывающего низкую смертность мышей и высокий процент хронической инфекции, позволит минимизировать количество используемых животных.

После инфицирования мышей проводится подсчет количества бактерий. Кроме того, для изучения язвенной реакции на бактериальную инфекцию можно провести анализ воспалительного ответа по общему и дифференциальному количеству клеток в бронхиальном секрете, анализ цитокинов в жидкости, определение активности миелопероксидазы и гистологический анализ. Не забывайте, что работа с оппортунистическими патогенами, такими как Pseudomonas, может быть опасной, поэтому необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, работа с бактериями в боксе биологической безопасности и применение стерильных методов.

Разработка подходящих моделей животных позволила провести доклинические испытания новых антибактериальных и противовоспалительных молекул. Это важный шаг для будущих терапевтических вмешательств при лечении легочных инфекций у пациентов с муковисцидозом или другими респираторными заболеваниями.