В пробирке методом наблюдать Е-селектин-опосредованных взаимодействий между простаты циркулирующих опухолевых клеток, взятых от пациентов и эндотелиальных клетках человека

Общая цель данной процедуры заключается в изучении взаимодействий между редкими клетками рака предстательной железы и эндотелиальными клетками, экспрессирующими E-селектин, с использованием микрофлюидной установки на предметном стекле. Для этого сначала поверхность микростекла покрывают фибронектином. На втором этапе в системе динамического потока на микростекле с узким каналом культивируют эндотелиальные клетки пупочной вены человека (VE).

Затем клетки рака предстательной железы маркируют гуманизированными моноклональными антителами к простат-специфическому мембранному антигену (PSMA), которые интернализируются. Заключительный этап заключается в перфузии маркированных анти-PSMA клетками рака предстательной железы через сосудистый эндотелий (VE), экспрессирующий E-селектин. В конечном итоге для визуализации взаимодействий между клетками рака предстательной железы и эндотелиальными клетками используется видеомикроскопия.

Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как камеры с параллельными пластинами и другие динамические установки, заключается в том, что он позволяет изучать взаимодействие между редкими клетками рака предстательной железы, например, циркулирующими опухолевыми клетками, и культивируемыми эндотелиальными клетками в системе с динамическим потоком. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования, такие как: каким образом клетки опухоли простаты метастазируют через систему кровеносных сосудов? Используют ли они те же механизмы, что и лейкоциты при их миграции?

Как правило, специалисты, впервые осваивающие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как он предполагает культивирование монослоя эндотелиальных клеток в узком канале в условиях перфузии внутри ламинарного шкафа для культивирования тканей. Сначала промойте микропрепарат фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Затем осторожно нанесите на микропрепарат 200 µL фибронектина в концентрации 50 µg/mL, используя шприц с Luer-Lock объемом 1 mL.

Накройте микропредметное стекло крышкой и оставьте его в ламинарном шкафу для культивирования тканей на 30 минут. Затем перфузируйте 200 µL теплой ростовой среды qve через микропредметное стекло и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Медленное дозирование жидкости в микропредметное стекло предотвращает образование пузырьков в канале.

Во время перфузии подготовьте суспензию vex, промыв vex раствором PBS и добавив 0,1% коллагеназы и 0,05% EDTA в PBS на одну-две минуты при комнатной температуре. Центрифугируйте hve в двух миллилитрах ростовой среды при 180 ×g в течение пяти минут. Затем измерьте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и приготовьте суспензию из 10 миллионов клеток на 100 µL ростовой среды.

Затем осторожно удалите среду из входного отверстия микрослайда. Поднесите микрослайд на уровень глаз и, используя наконечник дозатора на 200 µL и шприц с Luer-Lock объемом 1 мл, аккуратно введите 200 µL подготовленного раствора vex в канал. На этом этапе следует соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков воздуха; если пузырьки появились, продолжайте перфузию чуть дольше, пока они не выйдут через выпускной канал.

Затем дозируйте равный объем среды VE, примерно 80 µL, как во входное, так и в выходное отверстие микропрепарата. Это предотвратит перемещение клеток в обоих направлениях. Накройте препарат и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C на 1,5 часа.

Для начала сборки проточной камеры поместите стерильный шприц объемом 20 milliliter, соединители «папа» и «мама», шприцевой насос и трубки в инкубатор на 15 минут для минимизации мертвого объема. Используйте трубки с внутренним диаметром 0.04 inches. Меньший диаметр трубок предотвращает образование пузырьков.

Затем наполните шприц объемом 20 миллилитров 12 миллилитрами подогретой среды VE. Полностью удалите пузырьки воздуха из шприца. Заполните входное отверстие микрослайда средой VE.

Подсоедините этот узел к микрослайду. Осторожно закрепите выходной разъем на микрослайде. Поместите установку в инкубатор и подключите ее к шприцевому насосу.

Затем установите скорость потока насоса на 10 µL в минуту, после чего оставьте клетки в инкубаторе при 37 °C на ночь. На следующий день разберите установку, отсоединив коннектор от входа микрослайда. Затем удалите выходной коннектор, чтобы повысить экспрессию E-селектина на эндотелиальных клетках.

Приготовьте свежую ростовую среду, содержащую интерлейкин 1β. Наберите среду в шприц объемом 10 мл. Удалите остатки среды из входного отверстия предметного стекла, затем добавьте свежую среду, полностью заполнив входное отверстие.

Подсоедините шприц к предметному стеклу. Установите скорость подачи шприцевого насоса на 10 µL в минуту на четыре часа в инкубаторе во время инкубации vex с интерлейкином one beta; подготовьте клетки рака предстательной железы, меченные антителами anti PSMA Alexa 4 88. Сначала добавьте 0,05% трипсин-ЭДТА к клеткам рака предстательной железы MDA на одну минуту.

Не подвергайте клетки воздействию трипсина в течение длительного времени, так как это может повлиять на гликопептиды на поверхности клеток. Центрифугируйте клетки при 200 ×g в течение пяти минут. Затем ресуспендируйте осадок клеток MDA в 1 mL буфера Хэнкса, добавьте антитела к PSMA и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темном месте, периодически ресуспендируя клетки во время инкубации.

Через 30 минут центрифугируйте суспензию клеток при 800 ×g в течение пяти минут. Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре буфера Хэнкса. Подсчитайте количество меченных клеток MDA и доведите конечную концентрацию до 1 миллиона клеток на мл.

Наполните пятимиллилитровый шприц помеченными клетками MDA и удалите пузырьки воздуха. Включите инвертированный микроскоп и настройте освещение для анализа сдвига при использовании объектива 10x. Расположите шприцевой насос на одном уровне с предметным столиком микроскопа и установите напряжение сдвига равным 1 dime/cm².

Затем откройте программное обеспечение Zeiss Axio vision. Выберите объектив на экране компьютера. Создайте новую папку в разделе инструментов (tools) в программе.

Откройте опцию «smart experiments» в программе Axio vision и настройте параметры для записи коротких 32-секундных видеороликов в течение 30 минут. Для получения живого флуоресцентного видео настройте параметры изображения. Эти параметры позволяют добиться частоты кадров, близкой к стандартной для камеры Zeiss MRM, чтобы визуализировать всю ширину проточного канала при использовании объектива 10x на экране компьютера; используйте адаптер крепления CM. Включите ртутную лампу перед тем, как установить шприц и коннектор с клетками на шприцевой насос. Затем подсоедините коннектор к заполненному входному каналу микрослайда, содержащего стимулированные интерлейкином-1β клетки Ax.

Соедините выпускной канал с коннектором, прикрепленным к трубке. Поместите трубку в чашку или коническую пробирку объемом 15 milliliter для сбора проточной жидкости. Начните инфузию через микрослайд со скоростью 10 microliters в минуту.

Наблюдайте за взаимодействием эндотелиальных клеток с меченными клетками MDA или меченными CTC, полученными от пациентов, при длине волны 488 нанометров. Используйте фильтр на эпифлуоресцентном микроскопе. Запишите ход эксперимента в виде серии коротких видеороликов.

При анализе записи измерьте скорость роллинга. Скорость роллинга рассчитывается путем деления расстояния, пройденного клетками, на время. Здесь представлена культура монослоя эндотелиальных клеток после инкубации в течение ночи.

На микропрепарате. Масштабирование показывает, что при использовании объектива 5x видно 100% микропрепарата, а при использовании объектива 10x — 70%. Для выбранных опосредованных взаимодействий клетки, катящиеся по краям, не учитываются, что делает более 70% площади микропрепарата доступным для видеозаписи и последующего анализа. На диаграмме размаха представлено распределение скоростей роллинга немаркированных и маркированных анти-PSMA клеток MDA на эндотелиальных клетках, стимулированных интерлейкином 1-бета, при различных условиях напряжения сдвига.

При более высоком напряжении сдвига 10 дин/см² значимых различий в скоростях роллинга при значениях 1 и 5 дин/см² обнаружено не было. Было отмечено статистически значимое различие между скоростями роллинга немаркированных и маркированных анти-PSMA клеток MDA. Видео с объединением кадров, снятое с использованием крови пациента с раком предстательной железы, демонстрирует три типа взаимодействий между маркированными КТК предстательной железы и экспрессирующими лектин эндотелиальными клетками: тетеринг, при котором КТК прикрепляются и снова открепляются; стабильная адгезия, при которой КТК не откреплялись даже спустя 30 секунд; и отсутствие взаимодействий, когда невзаимодействующие КТК просто входят в поле зрения. Микропрепараты можно легко подвергнуть иммуноокрашиванию и флуоресцентной визуализации для подтверждения прочной адгезии маркированных анти-PSMA клеток MDA.

Здесь представлены эндотелиальные клетки, стимулированные интерлейкином 1β. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как с помощью данной процедуры исследовать взаимодействия между редкими клетками, такими как циркулирующие клетки опухоли предстательной железы, и экспрессирующими S-селектин эндотелиальными клетками. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о наличии лигандов S-селектина, также могут быть использованы другие методы, такие как иммунофлуоресценция.

Подобные методы могут помочь исследователям понять различные этапы, участвующие в метастазировании.