В пробирке методом наблюдать Е-селектин-опосредованных взаимодействий между простаты циркулирующих опухолевых клеток, взятых от пациентов и эндотелиальных клетках человека

Общая цель этой процедуры заключается в изучении взаимодействия между редкими клетками рака предстательной железы и эндотелиальными клетками, экспрессирующими e-селектин, с использованием сборки микрослайдового потока. Это достигается путем предварительного покрытия микропредметного стекла фибронектином. Вторым этапом является культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека или ЖЭ в системе динамического потока на микропредметном стекле с небольшой шириной канала.

Затем клетки рака предстательной железы помечаются антипростатическим специфическим мембранным антигеном или ПСМА-гуманизированным моноклональным антителом, которое интернализуется. Последним шагом является перфузия меченых анти-ПСМА клеток рака предстательной железы над селектином, экспрессирующим e. В конечном счете, видеомикроскопия используется для того, чтобы показать взаимодействие между клетками рака предстательной железы и эндотелиальными клетками.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как параллельная проточная камера с пластинами и другие динамические сборки, заключается в том, что с помощью этой методики можно исследовать взаимодействия между редкими клетками рака предстательной железы, такими как циркулирующие опухолевые клетки и культивируемые эндотелиальные клетки в динамической системе потока. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования, например, как клетки опухоли предстательной железы метастазируют через кровеносную сосудистую систему? Используют ли они тот же механизм, что и лейкоциты во время их формирования?

Как правило, люди, которые являются новичками в этом методе, будут испытывать трудности, потому что он включает в себя культивирование монослоя эндотелиальных клеток в узком канале под перфузией под капюшоном для культуры тканей. Сначала промойте микропредметное стекло фосфатно-солевым буфером или PBS. Затем аккуратно нанесите на микропредметное стекло 200 микролитров 50 микрограммов на миллилитр фибронектина с помощью одномиллилитрового шприца с замком приманки.

Накройте микропредметное стекло крышкой и подержите его внутри колпака для культуры тканей в течение 30 минут. Затем налейте 200 микролитров теплой питательной среды qve на микрогорку и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Медленное дозирование жидкости в микрослайде предотвращает образование пузырьков в канале.

Во время перфузии приготовьте суспензию векса, промыв векс PBS и добавив 0,1% коллагеназы плюс 0,05% ЭДТА в PBS в течение одной-двух минут при комнатной температуре. Центрифугируйте в двух миллилитрах питательной среды в 180 раз больше G в течение пяти минут. Затем измерьте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра и подготовьте 10 миллионов клеток на 100 микролитров питательной среды.

Далее аккуратно извлеките среду из входного отверстия микропредметного стекла. С помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров подведите микропредметное стекло к уровню глаз и с помощью одномиллилитрового шприца с замком приманки осторожно введите в канал 200 микролитров приготовленной концентрации векса. На этом этапе требуется осторожность, чтобы предотвратить образование пузырьков, если пузырьки появятся, продолжайте перфузию немного дольше, пока пузырьки не попадут в выпускной канал

Далее пипетка равного объема примерно 80 микролитров среды VE на входе и на выходе микростекла. Это препятствует потоку клеток в любом направлении. Накройте предметное стекло крышкой и подержите его в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов.

Чтобы начать сборку проточной камеры, поместите стерильный шприц объемом 20 миллилитров, гнездовые и мужские разъемы для приманки, шприцевой насос и трубку в инкубатор на 15 минут для минимального мертвого объема. Используются трубки с внутренним диаметром 0,04 дюйма. Меньший диаметр трубки предотвращает образование пузырьков.

Далее наполните 20-миллилитровый шприц 12 миллилитрами теплой среды VE. Полностью удалите пузырь из шприца. Заполните входное отверстие микрослайда средой VE.

Подсоедините эту сборку к микрослайду. Аккуратно прикрепите выходной разъем к микрослайду. Принесите установку в инкубатор и подключите ее к шприцевому насосу.

Затем установите насос на скорость сдвига 10 микролитров в минуту, прежде чем оставить клетки на ночь в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день разберите установку, сняв разъем, прикрепленный к входному отверстию микрослайда. Затем снимите второй выходной разъем для повышения экспрессии e-селектина на эндотелиальных клетках.

Приготовьте свежую питательную среду, содержащую интерлейкин один бета. Отсадите среду в 10-миллилитровый шприц. Удалите остатки среды с входного отверстия предметного стекла, затем добавьте свежую, полностью заполнив входное отверстие.

Подсоедините шприц к предметному стеклу. Установите шприцевой насос на скорость сдвига 10 мкл в минуту в течение четырех часов в инкубаторе во время интерлейкиновой одной бета-инкубации векса, приготовьте антитела против ПСМА Alexa 4 88 меченых клеток рака предстательной железы. Сначала добавьте 0,05% трипсина ЭДТА в клетки рака предстательной железы MDA в течение одной минуты.

Не подвергайте клетки воздействию трипсина в течение длительного времени, так как он может повлиять на гликопептиды, присутствующие на поверхности клетки. Центрифугируйте клетки при 200-кратном G в течение пяти минут. Затем повторно суспендируйте небо клеток MDA в одном миллилитре буфера Хэнка и добавьте антитела против ПСМА, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темном месте, подвешивая клетки во время инкубации.

Через 30 минут центрифугируйте клеточный раствор при 800-кратном G в течение пяти минут. Аспирируйте и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера Хэнка. Подсчитайте меченые клетки MDA и доведите итоговую концентрацию до 1 миллиона клеток на миллилитр.

Наполните пятимиллилитровый шприц помеченными клетками MDA и удалите пузырьки. Включите инвертированный микроскоп и установите подсветку бигуди на 10-кратный объектив. Подведите шприцевой насос на тот же уровень, что и предметный столик микроскопа, и установите его на напряжение сдвига один цент на квадратный сантиметр.

Затем откройте программное обеспечение для машинного зрения Zeiss Axio. Выберите цель на экране компьютера. Создайте новую папку в разделе «Инструменты» в программном обеспечении.

Откройте опцию умных экспериментов в Axio vision и отрегулируйте настройки, чтобы записывать короткие 32-е видео в течение 30 минут Для флуоресцентного видео в реальном времени установите параметры изображения. Эти параметры помогают получить видео, близкое к частоте кадров видео, с помощью камеры Zeiss MRM визуализировать всю ширину проточного канала с 10-кратным объективом на экране компьютера, использовать переключатель монтажа CM на ртутной лампе перед размещением шприца и разъема, содержащего элементы, на шприцевом насосе. Далее присоедините разъем к заполненному входному каналу микростекла, содержащего интерлейкин один бета-стимулированный топор.

Подсоедините выпускной канал с разъемом, прикрепленным к трубке. Поместите трубку в посуду или коническую трубку объемом 15 миллилитров, чтобы собрать поток. Начните инфузию через микрогорку со скоростью 10 микролитров в минуту.

Наблюдайте за взаимодействием между эндотелиальными клетками и мечеными клетками MDA или мечеными ЦОК, полученными от пациентов с длиной менее 488 нанометров. Отфильтруйте на эпифлуоресцентном микроскопе. Начните записывать эксперимент в виде 32-го короткого видеоролика.

Во время анализа воспроизведения измерьте скорость качения. Скорость качения измеряется путем деления расстояния, пройденного клетками во времени. Здесь показана ночная культура монослоя эндотелиальных клеток.

На микрогорке. Масштабирование показывает, что 100% микрослайда видно с помощью объектива с пятью увеличениями, в то время как 70% видно с помощью объектива с 10-кратным увеличением для выбранных опосредованных взаимодействий, ячейки, движущиеся по краям, не учитываются, что делает более 70% микрослайда доступным для записи видео и анализа воспроизведения. Ящичковая диаграмма показывает распределение скоростей вращения как немеченых, так и анти-ПСМА, меченых MDA-клеток на интерлейкиновых бета-стимулированных эндотелиальных клетках при различных условиях напряжения сдвига.

Не наблюдалось существенной разницы в скоростях качения при одном и пяти динах на квадратный сантиметр при более высоком чистом напряжении 10 десятицентовых центов на квадратный сантиметр. Статистически значимая разница наблюдалась между скоростями вращения немеченых и анти-ПСМА, меченых клеток MDA, Сшитое по времени видео, снятое с использованием крови пациента с раком предстательной железы, показывает три типа взаимодействий между мечеными ЦОК предстательной железы и лектином, экспрессирующими эндотелиальные клетки, связывание, где ЦОК присоединяются и снова присоединяются, стабильная адгезия, где ЦОК не отделяются даже через 30 секунд и не взаимодействуют, поскольку невзаимодействующие ЦОК попадают в поле зрения. С помощью микрослайдов можно легко иммуно окрашивать и флуоресцентно визуализировать твердую адгезию анти-ПСМА, меченых MDA-клеток.

После обильного воздействия на интерлейкин можно увидеть одну бета-стимулированную эндотелиальную клетку здесь. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать взаимодействие между редкими клетками, такими как циркулирующие опухолевые клетки предстательной железы и эндотелиальные клетки, экспрессирующие S-селектин, после этой процедуры. Другие методы, такие как иммунофлуоресценция, также могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как наличие селектина. Лигандов.

Подобные методы могут помочь исследователям понять различные этапы, связанные с метастазированием.