Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении точных позиций интеграции вирусных векторов в геном. Это достигается путем первоначальной линейной ПЦР с биотинилированными праймерами для обогащения последовательностей стыков векторного генома из геномной ДНК на твердой фазе в серии реакций; в результате генерируется двухцепочечная ДНК с известными последовательностями ДНК на обоих концах продукта, что позволяет проводить экспоненциальную амплификацию стыков векторного генома. Затем в продукты LAMP-ПЦР вводятся секвенирующие адаптеры.

Для секвенирования и характеристики неизвестных фланкирующих участков ДНК с помощью глубокого секвенирования используются эти фрагменты, которые позволяют выявить точные позиции интеграции вектора. Результатом является совокупность различных амплифицированных соединений, визуализируемых с помощью гель-электрофореза. Данный метод позволяет изучить распределение сайтов интеграции вирусного вектора у пациентов, проходящих клиническую генную терапию.

Данный метод также может быть применен в других исследованиях, таких как инсерционный мутагенез, скрининг, вирусное заражение, изучение рака, клональность стволовых клеток или разнообразие T-клеток. Процедуру продемонстрирует ina RA, техник моей лаборатории. Для выполнения этой процедуры сначала подготовьте линкерные кассеты: смешайте в микроцентрифужной пробирке по 40 µL каждого из двух LCO Legos со 110 µL трис-гидрохлорида и 10 µL хлорида магния. Затем инкубируйте смесь на нагревательном блоке при 95 °C в течение пяти минут, после чего медленно охладите до комнатной температуры в течение ночи.

На следующий день добавьте 300 µL воды к подготовленному двухцепочечному линкеру ДНК и профильтруйте смесь через микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте фильтр, чтобы собрать концентрированную ДНК линкера в пробирке. Затем извлеките пробирку из фильтра.

Добавьте 80 µL воды в пробирку и перемешайте пипеткой. Перенесите аликвоты по 10 µL в ПЦР-пробирки. Используйте ПЦР для преамплификации соединений генома вектора в реакционных пробирках объемом 50 µL для лямбда-фага.

Добавьте от 1 нг до 1 мкг ДНК образца на одну реакционную смесь объемом 50 мкл. Для образцов ДНК овец породы NR используйте не менее 100 нг ДНК. Не добавляйте более 25 мкл; проведите ПЦР в соответствии с таблицей 2 в тексте.

По завершении добавьте по 0.5 µL тех-контроля в каждую реакционную смесь и повторно запустите программу ПЦР. Сначала подготовьте магнитные частицы. Добавьте 20 µL магнитных частиц, покрытых стрептавидином, в пробирку объемом 1.5 мл и поместите их в сепаратор для магнитных частиц на одну минуту при комнатной температуре.

Затем слейте супернатант. Ресуспендируйте гранулы в 40 µL PBS с BSA и снова поместите их в сепаратор еще на одну минуту. Замените супернатант 20 µL промывочного раствора 3 M хлорида лития.

Снова поместите гранулы на сепаратор на одну минуту. Завершите процедуру, заменив супернатант 50 µL раствора хлорида лития с концентрацией 6 M. Теперь добавьте смесь магнитных гранул к продукту ПЦР и инкубируйте полученную смесь от двух часов до ночи при комнатной температуре при осторожном перемешивании.

Биотинилированная ДНК, полоски tava и покрытые микросферы образуют комплексы, которые можно хранить при температуре four degrees Celsius до четырех дней. Продолжите работу с lamb или NR lamb. Из-за высокой чувствительности L-A-M-P-C-R склонен к контаминации при невнимательном выполнении.

Это среда соответствующего класса чистоты для ПЦР. Особое внимание к чистоте имеет первостепенное значение. Чтобы успешно амплифицировать неизвестные фланкирующие участки ДНК, не загрязняя образцы, сначала подвергните комплексы воздействию сепаратора в течение одной минуты, а затем ресуспендируйте магнитные частицы с ДНК в 100 µL воды.

Затем поместите комплексы в сепаратор на одну минуту. В этот раз ресуспендируйте комплексы ДНК с магнитными частицами в смеси, содержащей 8,25 µL воды, 1 µL HEXA нуклеотидного буфера, 0,25 µL dNTPs и 0,5 µL кано-полимеразы.

Инкубируйте эту смесь при 37 °C в течение одного часа. Затем добавьте 90 µL воды и поместите реакционную смесь в сепаратор еще на одну минуту. После этого ресуспендируйте комплексы ДНК-гранул в 100 µL промывочной воды.

Используйте сепаратор еще одну минуту и подготовьте реакционную смесь для рестрикции. После удаления супернатанта добавьте 8.5 µL воды, 1 µL буфера для рестрикции и 0.5 µL фермента рестрикции.

При выборе рестриктазы убедитесь, что в области сайта связывания праймера, использованного в реакции амплификации, или ниже по течению от него отсутствуют сайты узнавания данного фермента. После инкубации с ферментами в течение одного часа при оптимальной температуре добавьте 90 µL воды. Используйте сепаратор в течение одной минуты и ресуспендируйте комплексы BDNA в 100 µL воды для промывки.

Повторите разделение и подготовьте реакцию лигирования. Добавьте к гранулам 5 µL воды, 1 µL 10x fast link buffer, 1 µL TP, 1 µL fast link DNA ligase и 1 µL линкерной кассеты, приготовленной в начале процедуры.

Проведите данную реакцию в течение пяти минут при комнатной температуре. Остановите реакцию, добавив 90 µL воды и отделив гранулы, после чего промойте их в 100 µL воды. Затем снова отделите гранулы; для денатурации синтезированной ДНК ресуспендируйте гранулы в 5 µL 0,1 н. гидроксида натрия и перемешивайте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем в течение одной минуты отделяют комплексы и собирают супернатант, содержащий предварительно амплифицированный стык векторного генома. Немедленно приступают к экспоненциальной амплификации или хранят пробу при -20 °C. Начните с экспозиции комплексов на сепараторе в течение одной минуты.

Затем ресуспендируйте ДНК-гранулы в 100 µL воды. Снова отделите их и удалите супернатант. Для реакции лигирования добавьте 6,5 µL воды, 1 µL циркулярной лигазы и 10-кратный реакционный буфер.

Добавьте 0,5 µL хлорида магния, 0,5 µL TP, 1 µL линкерных олигонуклеотидов SS и 0,5 µL циркулярной лигазы. Через час при температуре 60 °C остановите реакцию, добавив 90 µL воды, и с помощью магнитного сепаратора Resus ресуспендируйте гранулы еще в 100 µL воды; повторно используйте сепаратор и соберите промытые комплексы в 10 µL воды. Начните с приготовления мастер-микса для ПЦР, как описано в таблице 3 основного текста.

Добавьте 48 µL мастер-микса к 2 µL продуктов ягнят или NR ягнят в ПЦР-пробирки объемом 200 µL и проведите ПЦР, как описано в тексте. Ранее подготовьте дополнительное количество стрептавидин-бисеров и ресуспендируйте их в 6 M хлориде лития. Используйте 20 µL для ягнят или 50 µL для NR ягнят. Затем добавьте бисеры в такой же объем продуктов ПЦР-реакции и инкубируйте их на шейкере при 300 RPM в течение двух часов или в течение ночи при комнатной температуре, соберите комплекс ДНК-бисер и промойте его 100 µL воды, как было продемонстрировано ранее.

Теперь суспендируйте комплекс в 0,1 н. растворе гидроксида натрия и инкубируйте гранулы в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере. Затем поместите гранулы в сепаратор на одну минуту и соберите супернатант, содержащий амплифицированную ДНК, в новую пробирку. Используя амплифицированную ДНК в качестве матрицы, возьмите 2 µL этого раствора для проведения ПЦР согласно описанию в таблице 4 основного текста.

Визуализируйте продукты с помощью гель-электрофореза для их последующей очистки. Смешайте 40 µL продуктов с 44 µL магнитных частиц AMPure XP комнатной температуры и инкубируйте смесь в течение пяти минут. Затем отделяйте частицы на магните в течение двух минут.

После удаления супернатанта промойте гранулы дважды, используя 200 µL 70% этанола, а затем ресуспендируйте гранулы в 30 µL воды, добавив 40 ng праймера-фузии DNAA. Для добавления специфических адаптеров для секвенирования можно использовать ПЦР. Подробная информация приведена в таблице 5.

Проверьте продукты реакции на геле. Визуализация результатов ПЦР в режиме lamb с помощью гель-электрофореза с высоким разрешением является оптимальным выбором для сравнительного диагностического анализа. Хотя вариант с 2% agarose также применим, он менее эффективен.

Клональность NR LAMB и ПЦР-продуктов невозможно определить визуально. Однако 2% агарозного геля вполне достаточно для подтверждения успешности протокола. После секвенирования ПЦР-продуктов можно определить местоположение векторов в геноме хозяина.

На основе этих данных становится возможным регистрировать сайты вставки в кодирующих областях, а также вблизи сайтов начала транскрипции. После своей разработки эта методика открыла исследователям в области генной терапии путь к изучению биобезопасности векторов переноса генов как в доклинических моделях, так и в клинических испытаниях генной терапии.