Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении точных положений интегрирующих вирусных векторов в геноме. Это достигается за счет начальной линейной ПЦР-реакции с биотинилированными праймерами для обогащения векторных последовательностей соединений генома из геномной ДНК на твердой фазе в серии реакций генерируется двухцепочечная ДНК с известными последовательностями ДНК на обоих концах продукта, что позволяет осуществлять экспоненциальную амплификацию векторных соединений генома. Следующие адаптеры для секвенирования встраиваются в продукты ПЦР ягненка.

Для того, чтобы секвенировать и охарактеризовать неизвестную фланговую ДНК с помощью глубокого секвенирования, эти фрагменты выявляют точное положение векторных интеграций. В результате получается разнообразие усиленных соединений, наблюдаемых с помощью гель-электрофореза. Этот метод позволяет получить представление о распределении сайтов интеграции вирусного вектора у пациентов с клинической генной терапией.

Он также может быть применен к другим исследованиям, таким как инсерционный, мутагенез, скрининг, вирусная инфекция, рак, клональность стволовых клеток или разнообразие Т-клеток. Для этой процедуры сначала подготовьте линкерные кассеты, смешайте 40 микролитров каждого из двух LCO Lego со 110 микролитрами трис гидрохлорида и 10 микролитрами хлорида магния в микроцентрифужной пробирке. Затем установите смесь для инкубации на блоке с температурой 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем медленно охладите до комнатной температуры на ночь.

На следующий день добавьте 300 микролитров воды к подготовленному двухцепочечному линкеру, ДНК, и отфильтруйте их над микроцентрифужной пробиркой. Уменьшите скорость фильтра, чтобы собрать концентрированную линкерную ДНК в оуите. Далее извлекаем оуит из фильтра.

Добавьте в оуит 80 микролитров воды и пипетку. 10 микролитров аликвот в ПЦР-пробирки. Используйте ПЦР для предварительной амплификации соединений векторного генома в 50 микролитровых реакционных пробирках для ягненка.

Добавьте от одного нанограмма до одного микрограмма образца ДНК на 50 микролитров реакции. Для ягненка NR используйте не менее 100 нанограммов ДНК. Не добавляйте более 25 микролитров для выполнения ПЦР согласно таблице два в тексте.

А когда закончите, добавьте в каждую реакцию дополнительно 0,5 микролитра технологии и запустите программу ПЦР второй раз. Сначала подготовьте магнитные шарики. Добавьте 20 микролитров магнитных шариков с покрытием STREPT ENC в 1,5 миллилитровую трубку и поместите их на сепаратор магнитных шариков на одну минуту при комнатной температуре.

Затем отбросьте надосадочную жидкость для повышения. Суспензируйте шарики в 40 микролитрах PBS с BSA и положите бусины обратно на сепаратор еще на минуту. Замените надосадочную жидкость на 20 микролитров раствора трех моляров хлорида лития.

И снова кладем бусины на сепаратор на минуту. Завершите заменой надосадочной жидкости на 50 микролитров шестимолярного раствора хлорида лития. Теперь добавьте магнитную смесь шариков к продукту ПЦР-реакции и дайте этой смеси инкубироваться в течение двух часов до ночи при комнатной температуре с легким встряхиванием.

Биотинилированная ДНК и полосковая тава и покрытые бусины образуют комплексы, которые могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до четырех дней. Приступайте к баранине или ягненку NR из-за его высокой чувствительности. L-A-M-P-C-R подвержен загрязнению при тщательном выполнении.

Это среда класса ПЦР. И особое внимание к чистоте имеет первостепенное значение. Чтобы успешно амплифицировать неизвестную фланкирующую ДНК без загрязнения образцов, сначала подвергните комплексы воздействию сепаратора на минуту и суспендируйте шарики ДНК в 100 микролитрах воды.

Далее выставьте комплексы на сепаратор на минуту. И на этот раз ресуспендируют ДНК-гранулы комплексов в смеси с 8,25 микролитрами воды. Один микролитр нуклеотидного буфера HEXA, четверть микролитра D DN NTP и полмикролитра канополимеразы.

Выдерживайте эту смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Затем добавьте 90 микролитров воды и выставьте реакцию на сепаратор еще на минуту. Затем ресуспендируйте комплексы гранул ДНК в 100 микролитрах воды.

Используйте сепаратор еще минуту и приготовьте реакцию фермента рестрикции. После удаления надосадочной жидкости. Добавьте 8,5 микролитров воды, один микролитр буфера фермента рестрикции и половину микролитра фермента рестрикции.

При выборе фермента рестрикции убедитесь, что у него нет сайтов внутри или ниже по потоку первичного сайта связывания, используемого в реакции амплификации предэма. Дав ферментам вступить в реакцию в течение часа при идеальной температуре, добавьте 90 микролитров воды. Используйте сепаратор в течение минуты и повторно суспендируйте комплексы BDNA в смывке из 100 микролитров воды.

Повторите разделение и приготовьте реакцию лигирования. Добавляем в бусины пять микролитров воды, один микролитр 10 х быстрого буфера ссылок. Один микролитр ТП, один микролитр ДНК-лигазы быстрого линка и микролитр линкерной кассеты, изготовленной в начале процедуры.

Дайте этой реакции протекать в течение пяти минут при комнатной температуре. Завершите реакцию, добавив 90 микролитров воды и отделив бусины, после чего промойте в 100 микролитрах воды. А затем еще одно разделение, чтобы денатурировать синтезированную ДНК, ресуспендировать шарики в пяти микролитрах 0,1 нормального гидроксида натрия и дать смеси поболтать в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем отделяют комплексы на минуту и собирают SUP natin, который содержит преемно амплифицированное векторное соединение генома. Немедленно приступайте к экспоненциальному усилению или храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Начните с выставления комплексов на сепаратор на минуту.

И ресуссив шарики ДНК в 100 микролитрах воды. И снова разделяем их и удаляем надосадочную жидкость. Для реакции лигирования добавьте 6,5 микролитров воды, один микролитр цирковой лигазы, 10 х реакционного буфера.

Пол-микролитра хлорида магния, пол-микролитра ТП, один микролитр олиголикоса SS-линкера и пол-микролитра цир-лигазы. Через час при температуре 60 градусов Цельсия завершите реакцию с 90 микролитрами воды с помощью сепаратора Resus, суспендировав шарики еще по 100 микролитров, снова используя сепаратор и собрав промывочные комплексы в 10 микролитрах воды. Начните с подготовки мастер-смеси для ПЦР, как описано в таблице 3 текста.

Добавьте 48 микролитров мастер-смеси к двум микролитрам продуктов из баранины или NR из баранины в 200 микролитровых ПЦР-пробирках и запустите ПЦР, как описано в тексте, как и раньше, приготовьте больше стреппинга в бусинах и повторно суспендируйте их в шести молярах хлорида лития. Используйте 20 микролитров для баранины или 50 микролитров для ягненка NR. Затем добавьте шарики в тот же объем продуктов ПЦР-реакции и инкубируйте их в шейкере при 300 об/мин в течение двух часов до ночи при комнатной температуре, соберите комплекс шариков ДНК и промойте его 100 микролитрами воды, как было продемонстрировано ранее.

Теперь суспендируйте комплекс в 0,1 нормального гидроксида натрия и инкубируйте бусины в течение 10 минут при комнатной температуре на шейкере. Затем выставьте шарики на сепаратор на минуту и соберите надосадочную жидкость, содержащую амплифицированную ДНК, в новую пробирку. Используя амплифицированную ДНК в качестве шаблона, используйте два ее микролитра для проведения ПЦР, как описано в таблице 4 текста.

Визуализируйте продукты с помощью гель-электрофореза для очищения продуктов. Смешайте 40 микролитров из них с 44 микролитрами магнитных шариков комнатной температуры и инкубируйте их в течение пяти минут. Затем разделите бусины на две минуты на магните.

После удаления надосадочной жидкости дважды промойте шарики, используя 200 микролитров 70% этанола, а затем повторно суспендируйте шарики и 30 микролитров воды, используя 40 нанограммов праймера DNAA. ПЦР может быть использована для добавления адаптеров для секвенирования. Подробная информация приведена в таблице пять.

Проверьте средства на геле. Просмотр результатов ПЦР ягненка с помощью гель-электрофореза высокого разрешения является лучшим выбором диагностического анализа для сравнения. Хотя 2%aros также работает, он работает не так хорошо.

Клональность продуктов NR LAMB, ПЦР не может быть диагностирована визуально. Тем не менее, геля 2%agros вполне достаточно для определения успеха протокола. После секвенирования продуктов ПЦР расположение векторов можно найти в геноме хозяина.

На основе этих данных можно логировать местоположения сайтов вставки в регионах кодирования, а также приблизиться к сайтам начала транскрипции после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области генной терапии к изучению биобезопасности векторов переноса генов как в доклинических моделях, так и в клинических испытаниях генной терапии.