Обнаружение таргетируемых изменений при немелкоклеточном раке легкого с помощью секвенирования нового поколения
10 октября 2025 г.
Этот протокол описывает автоматизированный, аккредитованный ISO15189 рабочий процесс секвенирования нового поколения для обнаружения целевых геномных изменений в тканях, не связанных с формалином и залитым парафином при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ).
Мои исследования выявляют генетические мутации рака для улучшения диагностики и лечения. Для начала зарегистрируйте информацию об образце в Системе управления лабораторной информацией и заполните форму информированного согласия для тестирования на мутацию генов. С помощью одноразовых микротомных лезвий вырезали срезы из немелкоклеточного рака лёгких, формального и фиксированного образца с парафином.
Затем проводите рутинное окрашивание гематоксилином и эозином для оценки содержания опухолевых клеток. Для экстракции нуклеиновой кислоты с помощью микротома разрезают формальный и фиксированный парафиновый блок для получения ленты и помещают ленту в микроцентрифуговую трубку объемом 1,5 миллилитра. Перенесите трубку в назначенное место для входа образца на автоматическом инструменте для экстракции.
Далее используйте автоматический инструмент для экстракции с автоматическим набором для извлечения. Замените ручные этапы пипетирования на автоматическую систему экстракции нуклеиновых кислот с магнитными шариками. Затем выберите программу C1102 на инструменте.
Выберите время инкубации девоска образца в 16 часов и установите объём элусиана на 100 микролитров. Используйте спектрофотометрию для проверки чистоты ДНК. Затем используйте набор для обнаружения с последовательно-специфическими флуоресцентными красителями для проведения флуорометрического анализа с целью точного измерения концентрации ДНК.
Для получения фрагментированной геномной ДНК с помощью ультразвука смешайте 200 нанограммов геномной ДНК в 50 микролитрах буфера с низким уровнем трис-ЭДТА. Поместите пробирку в предварительно охлаждённую стойку, поддерживаемую при восьми градусах Цельсия. Настройте параметры прибора согласно протоколу и инициируйте фрагментацию ДНК.
Чтобы начать автоматическую подготовку библиотеки, нажмите кнопку питания, чтобы активировать систему, и дождитесь завершения инициализации. Перейдите в настройки программы, выберите запуск протокола и протокол BurningRock HS. Установите тип образца на высококачественную ДНК, входное количество нанограмм на 50, циклы до ПЦР на 12, а циклы после ПЦР — на 12. Затем нажмите «Запустить», чтобы продолжить.
Затем вставьте готовый реагентный картридж в назначенный слот инструмента, что автоматически подтвердит расположение и статус реагента. После загрузки сэмплов нажмите старт, чтобы запустить автономный запуск. Следите за индикаторами светодиодов на системе, чтобы отслеживать ход работы.
После завершения программы нажмите OK для подтверждения, и система автоматически перенесёт финальную библиотеку в библиотечную трубку, завершив подготовку библиотеки. Измерьте концентрацию как добиблиотеки, так и всей библиотеки с помощью флюорометрии. Разбавите библиотеку секвенирования до 1,6 пикомолярных и 1300 микролитров для операций секвенирования.
Контролируйте условия последовательности, поддерживая температуру в помещении и влажность в помещении. Полный контроль качества выходных данных прибора путём проверки базового качества выше Q 30 и фильтра плотности кластера. Оптимизированный процесс обнаружения надёжно выявил несколько клинически применимых геномных изменений в репрезентативных образцах опухолей.
Результаты секвенирования показали высокочастотное EGFR p. Миссенс-мутация L858R, сопровождаемая значительным увеличением числа копий гена EGFR. Наблюдалась умеренная амплификация гена MET и низкая амплификация гена BRAF.
Образец продемонстрировал промежуточную мутационную нагрузку и микросателлитную стабильность. Все целевые генные локусы, включая ALK, BRAF, KRAS и ROS1, достигли 100% показателя обнаружения в четырёх реплицированных экспериментах. Каждая мутация была последовательно обнаружена во всех четырёх повторных экспериментах, при этом ожидаемые значения численности оставались в пределах нормы флуктуаций; NJS обеспечивает компрессионный генетический профиль для немелкоклеточного рака лёгких, одновременно обнаруживая распространённые, редкие и новые гены.
Наши будущие исследования будут сосредоточены на сочетании молекулярной патологии с искусственным интеллектом для изучения новых биомаркеров рака легких.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан автоматизированный, аккредитованный по стандарту ISO15189 рабочий процесс секвенирования следующего поколения для выявления таргетных геномных изменений в тканях немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), фиксированных в формалине и залитых в парафин.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Геномика
- Патология
Теоретические основы
- Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является распространенным типом рака легкого.
- Выявление геномных изменений имеет решающее значение для применения таргетной терапии.
- В исследованиях рака часто используются ткани, фиксированные в формалине и залитые парафином.
- Автоматизированные рабочие процессы могут повысить эффективность и точность геномного тестирования.
Цель исследования
- Для создания надежного рабочего процесса секвенирования образцов НМРЛ.
- Для улучшения выявления таргетных геномных изменений.
- Для обеспечения соответствия стандартам ISO15189.
Используемые методы
- Зарегистрируйте информацию об образцах в лабораторной информационной системе управления (LIMS).
- Срежьте срезы из образцов, фиксированных в формалине и залитых парафином, используя ножи микротома.
- Выполните стандартное окрашивание гематоксилином и эозином для оценки содержания опухолевых клеток.
- Выделите нуклеиновые кислоты с помощью автоматического экстрактора.
Основные результаты
- Успешное извлечение нуклеиновых кислот из образцов НМРЛ.
- Получение высококачественных геномных данных о таргетных изменениях.
- Рабочий процесс продемонстрировал соответствие требованиям аккредитации ISO15189.
- Расширение диагностических возможностей для лечения НМРЛ.
Выводы
- Автоматизированный рабочий процесс секвенирования эффективен для НМРЛ.
- Соблюдение стандарта ISO15189 повышает достоверность результатов.
- Данный протокол может быть адаптирован для других типов рака.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Комплексное выявление клинически значимых геномных изменений при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) имеет решающее значение для прецизионной онкологии и развития портфеля препаратов. Автоматизированные рабочие процессы секвенирования следующего поколения (NGS), сертифицированные по стандарту ISO15189, позволяют с высокой степенью достоверности идентифицировать мутации, слияния и амплификации, что способствует надежной валидации мишеней и принятию решений с учетом оценки рисков. Стандартизированные, воспроизводимые процессы NGS снижают техническую вариабельность и ускоряют интеграцию трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает точную идентификацию драйверных мутаций и амплификаций генов для функциональной валидации мишеней.
- Способствует снижению биологических рисков за счет выявления как распространенных, так и редких геномных перестроек в образцах НМРЛ.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе мишени благодаря строгому контролю качества и согласованности реплик.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные геномные профили для последующего скрининга соединений и разработки анализа биомаркеров.
- Стандартизирует обработку образцов и подготовку библиотек для обеспечения воспроизводимости и количественной надежности.
- Автоматизированные рабочие процессы сводят к минимуму человеческий фактор, обеспечивая готовность к масштабируемому и высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает согласованность молекулярного профилирования с биомаркерами, имеющими значение для заболевания, для обеспечения трансляционной преемственности в исследованиях НМРЛ.
- Позволяет осуществлять развитие исследований с учетом рисков, предоставляя исчерпывающие данные о мутациях и амплификациях для доклинических моделей.
- Поддерживает интеграцию молекулярной патологии и поиск новых биомаркеров для будущих трансляционных исследований.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный рабочий процесс NGS связывает этапы предварительного поиска, валидации мишеней и трансляционных исследований, обеспечивая получение высокоточных геномных данных из клинических образцов НМРЛ.
- Биология открытий: обеспечивает надежную проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством комплексного выявления мутаций.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные геномные данные, подходящие для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: генерирует высококачественные, статистически валидированные результаты для сравнения различных условий и поддержки принятия решений.
- Трансляционные исследования: обеспечивает согласованность биомаркеров и преемственность от этапа открытия до доклинической валидации при НМРЛ.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную масштабируемую платформу для постоянного молекулярного профилирования в рамках онкологических портфелей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при выборе мишени.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность за счет автоматизации и строгого контроля качества.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала, предоставляя надежные геномные данные для сортировки портфеля проектов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков и продвигать разработку препаратов для лечения НМРЛ и других онкологических заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области молекулярной патологии, использования приборов для NGS и биоинформатического анализа.
- Необходим доступ к автоматизированным системам экстракции и подготовки библиотек с валидированными протоколами.
- Требуется межкомандная стандартизация входных образцов, пороговых значений контроля качества (QC) и интерпретации данных.
- Протоколы должны быть адаптированы к различной клеточности опухоли и качеству образцов FFPE.
- Сроки выполнения и техническая сложность остаются практическими аспектами при внедрении в клиническую и трансляционную практику.
