Супер-Resolution Imaging в естественных клеток-киллеров Иммунологические Synapse на стекло при поддержке Planar липидного бислоя

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как успешно получать изображения иммунологических синапсов естественных киллеров или NK-клеток со сверхвысоким разрешением на поддерживаемом липидном бислое. Это достигается путем создания плоского липидного бислоя со стеклянной опорой, содержащего антитела против рецептора, активирующего NK-клетки CD 16, в предметных стеклах камеры. Затем выделенные NK-клетки добавляют к планарному бислою липидов, встроенному в антитела, с последующим окрашиванием клеток factin и перфорином.

Заключительным этапом является визуализация полученных синапсов NK-клеток с помощью микроскопа, в конечном итоге визуализация NK-синапса на поддерживаемом липидном бислое. Использование stead показывает синапс NK-клеток с повышенной детализацией, что позволяет визуализировать ультраструктуру цитоскелета актина и перран положительных литических гранул, расположенных в областях с низкой плотностью F-актина. Таким образом, основная идея этой техники заключается в том, что стеклянная опора для простого липидного барьера может имитировать плюсовую мембрану клетки Така, белок на этом простом липидном барьере.

Они могут перемещаться латерально, что может лучше повторять образование очень логически релевантного иммуносинапса. Это послание может помочь ответить на вопросы ключевых христиан в области иммунологии, позволяя исследователям визуализировать образование синапсов контролируемым образом с деталями, что недостижимо при использовании коммерческих и микроскопических подходов. Постдок и грант аспиранта продемонстрируют процедуру сборки плоского липидного бислоя с опорой на стекло.

Сначала приготовьте 100 миллилитров раствора пираньи, смешав в этот раствор 30%-ную перекись водорода с серной кислотой в соотношении один к трем в стакане. Поместите два прямоугольных покровных стекла под номером 1,5 на 20-30 минут, пока они очищаются. Возьмите одну пробирку ранее приготовленных 400 микромолярных липидов DOPC и одну пробирку ранее приготовленных 80 микромолярных липидов биотина PE.

Транспортируйте их на льду в аргоновый резервуар после дезоксиоксинасыщения новой микроцентрифужной трубки аргоном. Сложите вместе DOPC и биотин PE в соотношении один к одному. Конкретный объем будет варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей, но должен составлять не менее двух микролитров.

Каждая пробирка с кислородом насыщает кислородом пробирку со смесью и отдельные пробирки с реагентами перед возвращением лестницы в холодильник. После того, как они закончат свою очистку, тщательно промойте покровные стекла дистиллированной водой. Установите крышку для сушки на воздухе в течение нескольких минут, затем извлеките 1,5 микролитра смеси липосом и аликвоты одной каплей в одну из камер камерного стекла.

Использование двух дропов на дорожку является типичным, но не обязательным. Теперь быстро и эффективно наденьте сухую защитную пленку на капли, убедитесь, что капли расположены на достаточном расстоянии, чтобы они не сливались после установки защитного стекла. Кроме того, следите за тем, чтобы капли оставались круглыми и четко очерченными, не касаясь краев стенок камеры.

Плотно надавите между каждой полосой движения и вокруг нее, чтобы обеспечить водонепроницаемое уплотнение между крышкой. Проведите пальцем и проведите пальцем по отметке положения капель маркером. Затем пропустите 100 микролитров водной 5%-ной оболочки через камеру, чтобы заблокировать бислой.

Постарайтесь убедиться в отсутствии пузырьков в проточной камере. Затем вводите по 100 микролитров стрепт-адина в концентрации 333 нанограмма на миллилитр в каждую дорожку. После инкубации в течение 10-15 минут при комнатной температуре промойте, пропустив три миллилитра кучи буферного физиологического раствора с 1% сывороточного альбумина человека через каждую дорожку.

Чтобы удалить избыток тритина, добавьте 100 микролитров биотинилированного флуоресцентно меченного анти-CD 16 в предварительно определенной концентрации белка, как описано в текстовом протоколе, после инкубации в темноте в течение 20-30 минут. Промойте еще раз, пропустив три миллилитра кучи буферного раствора с 1% альбумина сыворотки крови человека через каждую дорожку. Затем через камеру пропускают 100 микролитров D-биотина в концентрации 25 наномоляров, чтобы связать любой избыток STR-табина и таким образом исключить возможность неспецифического связывания STR-табина с клетками.

Затем подсчитайте NK-клетки человека и ресуспендируйте их в концентрации 500 000 на миллилитр в кучах буферизованного физиологического раствора с 1% сывороточного альбумина человека. Смойте D-биотин из камеры еще тремя миллилитрами буферного физиологического раствора с 1% альбумина сыворотки крови человека на полосу. После того, как клетки будут повторно суспендированы в нужной концентрации, добавьте по 100 микролитров в каждую дорожку.

Поместите камеру в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 30-60 минут. По истечении этого инкубационного периода зафиксируйте клетки 4%-ным параформным альдегидом при комнатной температуре на 10 – 20 минут. Промойте, пропустив три миллилитра фосфатно-солевого буфера через каждую дорожку, чтобы удалить параформный альдегид.

Затем добавьте 400 микролитров блокирующего буфера перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем окрашивают fактин и перфорин путем добавления двух микролитров разбавленного флуоресцентно меченного Фина и флуоресцентно меченного моноклонального антитела против перрана, инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа перед промывкой, пропуская через камеру три миллилитра фосфатно-солевого буфера. Камера готова к началу визуализации.

Включите все необходимые аппаратные модули микроскопа. Запустите программное обеспечение для анализа изображений и включите модули резонансного сканирования и STEAD. После выполнения этих действий подождите от трех до пяти минут, пока программное обеспечение не запустится.

Нажмите на вкладку конфигурации в верхней части экрана, выберите конфигурацию лазера. Затем включите белый свет и погасите лазеры с яркостью 592 нанометра. Выберите 100-кратный объектив и совместите лазерный луч возбуждения с лазером с обеднением 592 нанометров.

Выберите модуль конфигурации лазера, выключите лазер на истощение 592 и включите лазер на истощение 660 нанометров. Поместите слайд на сцену над объективом. Сфокусируйте клетки, связанные на отграниченной области бислоя, с помощью лампы белого света и окуляров.

Затем вернитесь на вкладку сбора данных прямо справа от вкладки конфигурации. Нажмите на вкладку переключения на белый свет, затем включите этот модуль и перетащите линию лазера возбуждения на соответствующую длину волны. После выбора нужного детектора и настройки диапазона обнаружения нажмите на кнопку последовательного сканирования на левой панели инструментов, чтобы открыть диалоговое окно последовательного сканирования в нижней части левой панели инструментов.

Это позволяет пользователю добавлять несколько последовательностей, каждая из которых имеет свой возбуждающий луч для другого цвета. Кликайте между кадрами, а затем установите частоту возбуждения, детектор и дальность обнаружения для каждого дополнительного цвета. После того, как все настройки будут оптимизированы, нажмите «Старт», чтобы начать процесс сбора.

Трехцветное постоянное изображение синапса NK-клеток на плоском липидном бислое со стеклянной опорой показывает, что анти-CD16-антитело, показанное красным цветом, накапливается на липидном бислое, вызывая образование F-актина, а поляризация и проникновение перфорина, показанное синим цветом, через f-актиновую сетку на фокальной панели. Используя этот комбинированный подход, можно четко наблюдать микрокластеры флуоресцентно меченых анти-CD-16 внутри липидного бислоя со стеклянной опорой, который непосредственно отражает кластеризацию CD-16 на NK-клетке. По сравнению с обычным конфокальным изображением, кольцевая структура центрального кластера CD 16 легче различима на более четком изображении из-за обедненной флуоресценции окружающей среды.

Кроме того, ультраструктура актинового цитоскелета видна со значительно улучшенным разрешением. В соответствии с предыдущими наблюдениями, положительные литические гранулы перина расположены над областями с низкой плотностью F-актина. На изображении вместо этого важная деталь, которая в основном теряется на конфокальном изображении После освоения эта техника может быть выполнена около четырех часов, если все сделано правильно во время ее прохождения.

Важно помнить о том, что образец должен быть дезоксигенирован путем многократного вытеснения кислорода аргонной, а при сборке камеры быстро накрыть образец защитным стеклом и погрузить его в раствор оболочки.