Супер-Resolution Imaging в естественных клеток-киллеров Иммунологические Synapse на стекло при поддержке Planar липидного бислоя

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ получения изображений иммунологических синапсов натуральных киллеров (NK-клеток) со сверхвысоким разрешением на поддерживаемом липидном бислое. Это достигается путем создания на предметных стеклах с камерой плоского липидного бислоя на стеклянной подложке, содержащего антитела к активирующему рецептору CD 16 NK-клеток. Затем предварительно выделенные NK-клетки добавляют к плоскому липидному бислою с встроенными антителами, после чего проводят окрашивание клеток на f-актин и перфорин.

Заключительным этапом является визуализация полученных синапсов NK-клеток с помощью микроскопа STEAD, в частности, получение изображений синапса NK-клетки на поддерживаемом липидном бислое. Использование STEAD позволяет рассмотреть синапс NK-клетки с повышенной детализацией, что дает возможность визуализировать ультраструктуру актинового цитоскелета и перфорин-положительные литические гранулы, расположенные над областями с низкой плотностью F-актина. Таким образом, основным преимуществом данной методики является то, что плоский липидный барьер на стеклянной подложке может имитировать плазматическую мембрану клетки-мишени и белки на этом плоском липидном барьере.

Они могут перемещаться латерально, что позволяет лучше воспроизвести формирование иммунологического синапса, имеющего критическое значение. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, позволяя исследователям детально и контролируемо визуализировать формирование синапса, что недостижимо при использовании коммерческих и микроскопических подходов. Постдок Пэйнтинг и аспирант Грант продемонстрируют процедуру сборки плоского липидного бислоя на стеклянной подложке.

Сначала приготовьте 100 миллилитров раствора Пираньи, смешав в стакане 30% перекись водорода с серной кислотой в соотношении один к трем. Поместите два прямоугольных покровных стекла номер 1.5 в этот раствор на 20–30 минут для очистки. Возьмите одну пробирку с предварительно приготовленными липидами DOPC в концентрации 400 micromolar и одну пробирку с предварительно приготовленными липидами biotin PE в концентрации 80 micromolar.

Перенесите их на льду к баллону с аргоном после дезоксигенации новой микроцентрифужной пробирки аргоном. Смешайте DOPC и биотинилированный PE в соотношении один к одному. Конкретный объем будет зависеть от целей эксперимента, но должен составлять не менее 2 µL.

Плотно закройте пробирку со смесью и пробирки с отдельными реагентами перед тем, как убрать их в холодильник. После завершения работы тщательно промойте покровные стекла дистиллированной водой. Оставьте покровные стекла подсохнуть на воздухе в течение нескольких минут, затем отберите 1.5 µL липосомальной смеси и нанесите одну каплю в одну из лунок камерного предметного стекла.

Использование двух капель на одну дорожку является типичным, но не обязательным. Теперь быстро и аккуратно накройте капли сухим покровным стеклом; при этом убедитесь, что расстояние между каплями достаточно велико, чтобы они не слились после наложения стекла. Кроме того, убедитесь, что капли остаются круглыми и четко очерченными, не касаясь стенок камеры.

Плотно прижмите области между каждой дорожкой и вокруг них, чтобы обеспечить герметичность прилегания крышки. Отметьте места нанесения капель с помощью маркера. Затем пропустите 100 µL 5% водного раствора казеина через камеру для блокировки бислоя.

Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в проточной кювете. Затем введите по 100 µL стрептавидина в концентрации 333 ng/mL в каждый канал. После инкубации в течение 10–15 минут при комнатной температуре промойте каждый канал, пропустив через него 3 mL фосфатно-солевого буфера (PBS) с 1% человеческого сывороточного альбумина.

Для удаления избытка стрептавидина добавьте 100 µL биотинилированных флуоресцентно-меченных антител к CD 16 в концентрации белка, определенной ранее согласно текстовому протоколу, и инкубируйте в темноте от 20 до 30 минут. Повторно промойте систему, пропустив через каждый канал 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с 1% человеческого сывороточного альбумина. Затем пропустите через камеру 100 µL D-биотина в концентрации 25 nM, чтобы связать любой избыток стрептавидина и тем самым исключить возможность его неспецифического связывания с клетками.

Затем подсчитайте количество NK-клеток человека и ресуспендируйте их до концентрации 500, 000 на миллилитр в HEPES-буферном солевом растворе с 1% человеческим сывороточным альбумином. Вымойте D-биотин из камеры, используя еще по три миллилитра HEPES-буферного солевого раствора с 1% человеческим сывороточным альбумином на каждую дорожку. После того как клетки будут ресуспендированы до нужной концентрации, добавьте по 100 microliters в каждую дорожку.

Поместите камеру в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide на 30–60 минут. После этого периода инкубации зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 10–20 минут. Промойте, пропустив три миллилитра фосфатно-солевого буферного раствора через каждый канал, чтобы удалить параформальдегид.

Затем добавьте 400 µL блокирующего буфера и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее проведите окрашивание f-актина и перфорина, добавив 2 µL разведенного флуоресцентно меченого Phin и флуоресцентно меченого моноклонального антитела к перфорину; инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, после чего промойте камеру, пропустив через нее 3 mL фосфатно-солевого буфера. Теперь камера готова к началу визуализации.

Включите все необходимые аппаратные модули микроскопа STEAD. Запустите программное обеспечение для анализа изображений и активируйте модули резонансного сканирования и STEAD. После этого подождите примерно от трех до пяти минут до полной инициализации программного обеспечения.

Нажмите на вкладку конфигурации (configuration) в верхней части экрана и выберите настройку лазера (laser config). Затем включите белый свет и стационарные лазеры с длиной волны 592 нм. Выберите объектив 100x и совместите луч лазера возбуждения с лазером обеднения 592 нм.

Выберите модуль конфигурации лазера, выключите лазер обеднения 592 нм и включите лазер обеднения 660 нм. Поместите предметное стекло на предметный столик над объективом. С помощью лампы белого света и окуляров сфокусируйтесь на клетках, закрепленных в обозначенной области бислоя.

Затем вернитесь на вкладку сбора данных (acquisition), которая находится справа от вкладки конфигурации. Нажмите на вкладку переключения на белый свет (switch to white light), включите этот модуль и переместите линию возбуждающего лазера на соответствующую длину волны. После выбора нужного детектора и настройки диапазона детектирования нажмите кнопку последовательного сканирования (sequential) на панели инструментов сбора данных слева, чтобы вызвать диалоговое окно последовательного сканирования в нижней части этой панели.

Это позволяет пользователю добавлять несколько последовательностей, каждая из которых имеет отдельный возбуждающий луч для соответствующего цвета. Щелкните между кадрами, а затем установите детектор частоты возбуждения и диапазон детектирования для каждого дополнительного цвета. После оптимизации всех настроек нажмите «Start», чтобы начать процесс сбора данных.

Трехцветное изображение синапса NK-клетки на плоском липидном бислое, закрепленном на стекле, полученное методом STEAD, показывает, что антитела к CD 16 (показаны красным) накапливаются на липидном бислое, запуская формирование F-актина, а также поляризацию и проникновение перфорина (показаны синим) через сеть F-актина в фокальной панели. Используя этот комбинированный подход, можно четко наблюдать микрокластеры флуоресцентно меченных антител к CD 16 внутри липидного бислоя на стеклянной подложке, что напрямую отражает кластеризацию CD 16 на NK-клетке. По сравнению с традиционным конфокальным изображением, кольцевая структура центрального кластера CD 16 на STEAD-изображении распознается легче благодаря снижению фоновой флуоресценции.

Кроме того, ультраструктура актинового цитоскелета видна со значительно более высоким разрешением. В соответствии с предыдущими наблюдениями, perin-положительные литические гранулы расположены над областями с низкой плотностью F-актина. На STEAD-изображении видна важная деталь, которая в основном теряется на конфокальном изображении. После освоения эта методика может занимать около четырех часов при правильном выполнении всех этапов.

Важно помнить о необходимости поддерживать отсутствие кислорода в образце путем многократного вытеснения его аргоном, а также при сборке камеры — за счет быстрого наложения покровного стекла на образец и его погружения в раствор для герметизации.