Визуализация иммунологических синапсов на двойной цвет времени закрытого вынужденного излучения истощения (STED) Наноскопия

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации структур, таких как F-актин в литическом синапсе NK-клеток с помощью микроскопии TED. Это достигается путем предварительного повторения синапса на стекле с использованием активирующего антитела. Вторым этапом процедуры является фиксация пермы и окрашивание клеток для интересующих структур.

Затем слайды визуализируются с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с последующим применением устойчивого истощения для увеличения разрешения изображения. Заключительным этапом является обработка изображений с помощью алгоритма деконволюции. В конечном счете, результаты могут показать разрешение клеточных структур менее 100 нанометров благодаря двухцветной стеде и эндоскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, такие как взаимосвязь между цитоскелетом и экзоцитозом. В нашем случае нас интересует секреция естественных клеток-киллеров специализированных лизосом, называемых литическими гранулами. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что существует множество переменных, которые могут быть скорректированы при применении лазера истощения TED.

Неправильное применение истощающего пучка приведет к ухудшению, а не к улучшению разрешения При подготовке нагрейте 30 миллилитров среды RPMI с 10% FCS и отдельно. Один миллилитр BD CY воздействует на химическую завивку до 37 градусов Цельсия. Затем начинают процесс покрытия покровных листов антителами.

Возьмите обложку под номером 1.5 и используйте ручку PAP. Сделайте квадраты размером с десятицентовую монету на покровных листах. Подготовьте по одному квадрату для каждого тестируемого условия.

Загрузите в каждый кружок 200 микролитров антител из расчета пять микрограммов на миллилитр в PBS. Для активации клеток NK 92 используйте антитела против CD 18 и против NK P 30. Инкубируйте загруженные крышки при температуре 37 градусов Цельсия в течение получаса, а затем смойте их погружением в комнатную температуру PBS приступайте немедленно с добавлением элементов для каждого тестируемого состояния, 500 000 элементов должны быть готовы к использованию.

Промойте клетки в 10 миллилитрах предварительно подогретой среды, а затем повторно суспендируйте их в той же подогретой среде. При концентрации 2,5 миллиона клеток на миллилитр, когда клетки полностью находятся в суспензии, сцеживайте 200 микролитров в каждый квадрат антител на крышке. Достаточно 20 минут, чтобы поляризовать гранулы в NK-клетках после инкубационной промывки, крышка аккуратно скользит в PBS при комнатной температуре.

Начните с добавления микролитра TRITTON X 100 к миллилитру теплого раствора BD CY effects cyto perm. Затем вихрь. Нанесите по 200 микролитров этого раствора на каждый квадрат состояния на покровных листах.

Затем поместите клетки в темноту при комнатной температуре и подождите 10 минут. Когда инкубация будет завершена, аккуратно промойте крышку в буфере для окрашивания. Затем высушите края окруженных участков ватным тампоном.

Далее добавьте 200 микролитров первичного антитела в буфер для окрашивания в окружающие участки и дайте покровным стеклам инкубироваться в темноте в течение получаса. Некоторые хорошие вторичные антитела для визуализации включают Alexa floor 4, 88 Pacific orange и Horizon V 500. Каждый из них хорошо работает при разведении от одного до 200

После инкубационной промывки крышка скользит в красители, буферизуйте и промокните их насухо. Как и раньше, нанесите по 200 микролитров вторичного антитела на каждый квадрат состояния. Затем дайте им посидеть в темноте еще 30 минут.

На этом этапе можно добавить дополнительные антитела после дополнительных мытья. Например, Phin можно применять в соотношении от одного до 200 для обнаружения f-актина. В качестве монтажного носителя выбирайте prolong вместо vector shield, который не совместим со stead.

Если используется окрашивание фином, избегайте использования двух двух этанолов, в то время как это нормально, теперь нанесите от 10 до 20 микролитров монтажной среды на предметное стекло. С перевернутым клапаном крышки аккуратно опустите ее в среду, не допуская образования пузырьков воздуха. Затем выдержать предметное стекло в течение 24 часов.

С чехлом слипнитесь на следующий день, заклейте чехол лаком для ногтей и приступайте к визуализации. Запустите лазеры и программное обеспечение. Лазер на истощение должен прогреться на 100% мощности и быть выровнен.

С помощью окуляра сфокусируйтесь на образце, затем обратитесь к программному обеспечению. Отсканируйте первый канал, который имеет самую длинную длину волны. Четвертый этаж, оптимизируйте мощность лазера, положение возбуждающего луча и дальность действия детектора.

Не устанавливайте значение выше 100. Затем сделайте конфокальный снимок и проверьте наличие пикселя. Насыщенность, усреднение линий и кадров повысят разрешение в пикселях.

Цель состоит в том, чтобы быть ниже 30 нанометров на пиксель. Некоторая насыщенность приемлема для stead. Затем примените устойчивый истощающий луч на 50% мощности и сделайте снимок.

Если разрешение улучшится, можно будет применить больше энергии. Кроме того, регулировка мощности возбуждающего лазера, среднего значения линии или усиления также может улучшить разрешение. Для уменьшения фона примените стробирование времени на 0,3 наносекунды и отрегулируйте в сторону увеличения.

Новое разрешение должно быть оценено с помощью вычисления максимальной половины ширины. Когда все будет удовлетворено, повторите эти шаги со вторым каналом, когда все каналы будут настроены. Проверьте спектральное перекрытие путем визуализации контрольных полос с одним пятном со всеми последовательностями сканирования.

Легкое перекрытие может быть скорректировано с помощью программного обеспечения с помощью спектрального расмешивания, но его лучше избегать или свести к минимуму. Теперь получите изображения для количественной визуализации. Получите не менее 20 изображений по каждому условию в соответствии с условиями эксперимента.

Чтобы перенести сохраненные изображения, откройте файлы в соответствующем программном обеспечении. Проверьте параметры каждого канала, в частности, спектры возбуждения и впуска, постоянное истощение излучения и направление изображения. Затем примените расчеты деконволюции программного обеспечения.

Обычно достаточно настроек по умолчанию, но сигнал к шуму будет варьироваться в зависимости от силы на полу, поэтому этот параметр необходимо установить вручную для эксперимента. Есть несколько распространенных ловушек, которые могут привести к неоптимальному разрешению с stead. Один из них находится в процессе отбора проб.

Это приводит к зернистости и потере пиксельной информации, как в этих f-актиновых филаментах. Увеличение усреднения линии или кадра часто решает эту проблему. Еще одна проблема — обесцвечивание или передискретизация, вызванные длинным пикселем.

Время задержки, обычно из-за чрезмерного усреднения линий при сканировании перед получением изображения, также может быть виновником и может быть скорректировано с помощью меньшего сканирования перед получением изображений или с помощью более высокой скорости сканирования. Снижение мощности лазера также может помочь в работе всего оборудования. Изображение значительно улучшится.

Деконволюция еще больше улучшит изображение. Как количественно, так и качественно. Разрешение менее 100 нанометров должно быть обычно получено при попытке выполнения этой процедуры.

Важно помнить о выполнении юстировки стационарного луча перед каждым экспериментом и примерно раз в час после этой процедуры. Другие методы, такие как количественный анализ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся колокализации, субклеточной локализации и молекулярных взаимодействий.