Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

Общая цель теста на раздражение глаз заключается в классификации и маркировке веществ и смесей в соответствии с их потенциалом раздражения глаз. В этой процедуре используется трехмерная реконструированная модель роговицы, подобная ткани. По прибытии тест-набор предварительно инкубируется в течение ночи в пробирной среде на следующий день, ткани гидратируются, после чего местное нанесение положительного и отрицательного контроля и исследуемых химических веществ на поверхность тканей в двух экземплярах.

После фиксированного периода воздействия тестовые химические вещества удаляются путем промывки. Ткани после инкубации в свежей среде для анализа, а затем токсичность химических веществ оценивается с помощью анализа МТТ. В конечном счете, раздражающий потенциал испытуемых изделий может быть оценен путем сравнения относительной жизнеспособности тканей, обработанных испытуемым изделием, с тканями, обработанными негативным контролем.

Основным преимуществом данной методики из существующих методик, подобных экспресс-тестам на следовое раздражение, является то, что в ней не задействованы лабораторные животные. Он использует in vitro деконструированную роговицу, похожую на ткань глаз, которая состоит из нормальных клеток человека. Он применим ко всем типам веществ и смесей и может различать химические вещества, вызывающие раздражение глаз или серьезное повреждение глаз материалами.

Не раздражающие вещества, не требующие классификации и маркировки. Реконструированная роговица человека похожа на эпителиальную ткань или эпи. Глаз готовится во вкладышах с пористой оболочкой, через которую питательные вещества переходят к клеткам.

Реконструированная ткань образует неороговевший эпителий, который моделирует эпителий роговицы с прогрессивно стратифицированными, но не ороговевшими клетками. После получения набора эпителиальных клеток роговицы человека уравновесьте ткани в транспортировочном контейнере на 24 лунки до комнатной температуры Через 15 минут откройте пакет, содержащий тканевую пластину на 24 лунки, в стерильных условиях и осмотрите все ткани на наличие пузырьков воздуха между гелем и вставками. Резать. Откройте ленту.

Снимите чехол со стерильной марлей и осмотрите поверхность ткани. Далее аликвотируется один миллилитр 37 градусов Цельсия из набора пробирной среды в лунки предварительно маркированных шести луночных планшетов. Затем с помощью стерильных щипцов аккуратно промокните ткань, содержащую вкладыши, на стерильной марле, чтобы удалить все остатки транспортировки, и поместите их в отдельные лунки из шести луночных планшетов.

Через час замените среду одним миллилитром свежей среды для анализа с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте ткани в стандартных условиях культивирования в течение ночи. На следующий день я наношу по 20 микролитров DPBS без кальция и магния на апикальную поверхность каждой ткани. Если DPBS не распространяется по тканям, аккуратно удерживайте вставку щипцами и постучите по пластине, чтобы физиологический раствор намочил всю поверхность ткани.

Инкубируйте пластины в течение 30 минут. Затем для обработки тканей жидкими исследуемыми изделиями нанесите 50 мкл отрицательного контроля, положительного контроля и соответствующих исследуемых изделий в двух экземплярах в соответствии с графиком. Убедитесь, что процедуры охватывают всю поверхность тканей, а затем инкубируйте вкладыши в течение 30 минут, чтобы обработать ткани твердыми тестовыми изделиями.

Сначала перенесите вставки на стерильную поверхность. Держите пластину накрытой, чтобы предотвратить загрязнение взвешенными в воздухе твердыми частицами. Затем с помощью выровненной ложки местно нанесите 50 миллиграммов испытуемого изделия на дубликаты тканей в соответствии с графиком, следя за тем, чтобы лечение охватывало всю поверхность ткани.

В качестве альтернативы можно использовать предварительно заполненный шприц объемом в один миллилитр с отрезанной головкой. Поместить порошки непосредственно на культуру. Нажмите на поршень, чтобы нанести порошок сразу после нанесения твердых тестовых изделий, верните вкладыши на их шестилуночные планшеты и инкубируйте ткани в течение шести часов, чтобы промыть ткани.

После обработки заполните 3 стакана по 150 миллилитров на испытуемое изделие 100 миллилитрами DPBS в конце экспозиционной инкубации. Возьмитесь за верхний край вставок изогнутыми щипцами, чтобы извлечь их из лунок. Затем с помощью щипцов возьмите за верхние края два вкладыша от одной и той же процедуры и сцедите обработанные средства на чистый абсорбирующий материал.

Далее опустите вставки в первую мензурку DPBS, смывая салфетки круговыми вращательными движениями в течение двух секунд. Затем поднимите вкладыши так, чтобы они были в основном заполнены DPBS, и сцедите жидкость обратно в стакан. Повторите стирку два раза в первом стакане.

Затем промойте вставки во втором и третьем стаканах DPB S3 каждый раз таким же образом после последней стирки. Поверните каждую вставку примерно под углом 45 градусов открытым концом вниз и прикоснитесь верхней губой к абсорбирующему материалу, чтобы сцедить остатки DPBS. Затем сразу же погрузите ткани в пять миллилитров среды для анализа комнатной температуры.

В предварительно маркированной 12-луночной пластине в конце периода погружения после замачивания сцедите пробирную среду и промокните вкладыши на абсорбирующем материале. Затем переложите вкладыши в новую шестилуночную пластину, содержащую один миллилитр теплой среды для анализа на лунку, и поместите пластины в инкубатор, чтобы начать анализ жизнеспособности MTT. Переложите вкладыши в 24-луночную пластину, содержащую 0,3 миллилитра свежеприготовленного раствора МТТ.

Промокните вставки на абсорбирующем материале перед переносом. Выпустите все пузырьки воздуха, попавшие под вкладышами, и верните салфетки в инкубатор через три часа, промокнув дно вкладышей на абсорбирующем материале. Затем для погружной экстракции некрасящих жидких испытуемых изделий погрузите вкладыши в предварительно маркированную 24-луночную пластину, содержащую два миллилитра соответствующего экстракционного раствора на лунку для непогружной экстракции твердых или жидких красителей.

Переложите вкладыши в предварительно маркированную шестилуночную пластину, содержащую один миллилитр экстракционного раствора на лунку. Затем запечатайте пластины термосварщиком или параформой, чтобы предотвратить испарение, и экстрагируйте на орбитальном шейкере в течение двух-трех часов при комнатной температуре с легким встряхиванием в конце погруженной экстракции. Проколите ткани, а затем сцедите жидкость из каждой вставки обратно в ткань, а затем выбросьте вставки вместе с салфетками.

Смешайте раствор экстракта в каждой лунке и переведите две аликвоты по 200 микролитров каждого образца в соответствующие лунки предварительно маркированной 96-луночной пластины, как показано на схеме в конце погруженной экстракции. Отбросьте вкладыши и салфетки без прокалывания и добавьте в каждую по одному миллилитру экстракционного раствора. Хорошо перемешайте экстрагирующий раствор в лунках и перенесите две аликвоты по 200 микролитров из каждого образца в соответствующие лунки предварительно маркированной 96-луночной пластины, как показано выше.

Наконец, считайте оптическую плотность образцов на 96-луночном спектрофотометре на длине волны 570 нанометров без использования эталонного фильтра и введите результаты в электронную таблицу, чтобы рассчитать соответствующие тканевые нагрузки. Учитывайте поправки из-за химического вмешательства в тест, как указано в текстовом протоколе здесь, в этом эксперименте показаны репрезентативные результаты теста на раздражение глаз, проведенного с 10 тестовыми изделиями, а также отрицательные и положительные контрольные показатели. Средняя оптическая плотность 1,31 для отрицательного контроля, соответствующая 100% жизнеспособности тканей, наблюдалась при относительной жизнеспособности тканей 31,2%. Для положительных контрольных тестов изделия 1, 2, 4, 7 и 8 показали тканевую вариабельность более 60%, классифицируя эти изделия как нераздражающие тесты на изделия 3, 5, 6, 9 и 10.

С другой стороны, наблюдалась вариабельность тканей менее или равная 60%, что привело к их классификации как раздражителей. Разница в жизнеспособности тканей между дубликатами тканей в этом эксперименте составила менее 20% для всех протестированных изделий, за исключением второго тестового изделия. Таким образом, результаты для всех тестовых изделий, за исключением второго, были признаны квалифицированными, поскольку они соответствовали всем критериям приемлемости теста на раздражение глаз.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как следует проводить тест DICATION с использованием in vitro реконструктивной модели роговицы человека, как ткани номер четыре, идентификации опасности, маркировки химического вещества. Эта процедура была реализована в руководстве по тестированию EOC D как часть стратегии тестирования уровня.