Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

Общая цель теста на раздражение глаз состоит в том, чтобы классифицировать и маркировать вещества и смеси в соответствии с их потенциалом вызывать раздражение глаз. В данной процедуре используется трехмерная реконструированная модель ткани, подобная роговице. После получения набора для тестирования он предварительно инкубируется в течение ночи в среде для анализа; на следующий день ткани гидратируют, после чего на поверхность тканей в двух повторностях наносят положительный и отрицательный контроли, а также исследуемые химические вещества.

После фиксированного периода экспозиции тестируемые вещества удаляют путем промывки. Ткани подвергают последующей инкубации в свежей среде для анализа, после чего токсичность химических веществ оценивают с помощью МТТ-теста. В конечном итоге раздражающий потенциал исследуемых образцов можно оценить, сравнив относительную жизнеспособность тканей, обработанных исследуемым образцом, с жизнеспособностью тканей отрицательного контроля.

Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как экспресс-тесты на раздражение, является отсутствие необходимости использования лабораторных животных. В ней применяется модель глазной ткани, имитирующая роговицу in vitro, которая состоит из нормальных человеческих клеток. Метод применим ко всем видам веществ и смесей и позволяет дифференцировать химические вещества, вызывающие раздражение глаз или серьезное повреждение глаз, от безопасных материалов.

Нераздражающие вещества, не требующие классификации и маркировки. Реконструированная эпителиальная ткань, подобная роговице человека, или epi. Ocular подготавливается в инсертах с пористой мембраной, через которую питательные вещества поступают к клеткам.

Реконструированная ткань образует некератинизированный эпителий, который моделирует эпителий роговицы с постепенно стратифицируемыми, но не ороговевшими клетками. После получения набора для создания эпителия, подобного человеческой роговице, выдержите ткани в транспортном контейнере на 24 лунки при комнатной температуре. Через 15 минут в стерильных условиях откройте пакет с 24-луночным планшетом с тканями и осмотрите все образцы на наличие пузырьков воздуха между агарозным гелем и вставками. Отрежьте. Снимите ленту.

Снимите крышку с помощью стерильной марли и осмотрите поверхность ткани. Затем внесите по 1 mL assay medium из набора, подогретого до 37 °C, в лунки предварительно маркированных 6-луночных планшетов. После этого с помощью стерильного пинцета осторожно промокните стерильной марлей вставки с тканью, чтобы удалить остатки транспортной среды, и поместите их в отдельные лунки 6-луночных планшетов.

Через один час замените среду на один миллилитр свежей assay medium при 37 °C и инкубируйте ткани в стандартных условиях культивирования в течение ночи. На следующий день нанесите 20 µL DPBS без кальция и магния на апикальную поверхность каждой ткани. Если DPBS не распределяется по тканям, осторожно удержите вставку пинцетом и слегка постучите по планшету, чтобы физраствор полностью смочил поверхность ткани.

Инкубируйте планшеты в течение 30 минут. Затем для обработки тканей жидкими исследуемыми веществами нанесите по 50 µL отрицательного контроля, положительного контроля и соответствующих исследуемых веществ в двух повторностях согласно графику. Убедитесь, что исследуемые вещества покрывают всю поверхность тканей, а затем инкубируйте вставки в течение 30 минут для обработки тканей твердыми исследуемыми веществами.

Сначала перенесите вставки на стерильную поверхность. Держите планшет закрытым, чтобы предотвратить загрязнение твердыми частицами из воздуха. Затем с помощью выровненной ложки нанесите топически 50 milligrams исследуемого вещества на дубликаты тканей в соответствии с графиком, следя за тем, чтобы препарат покрывал всю поверхность ткани.

В качестве альтернативы используйте предварительно заполненный шприц объемом 1 мл с отсеченным носиком, чтобы нанести порошки непосредственно на культуру. Нажмите на поршень для нанесения порошка сразу после внесения твердых исследуемых объектов, верните вставки в 6-луночные планшеты и инкубируйте ткани в течение 6 часов для промывки тканей.

После обработки, в конце инкубационного периода воздействия, наполните по 3 стакана объемом 150 мл для каждого исследуемого объекта 100 мл DPBS. Захватите верхний край вставок изогнутым пинцетом, чтобы извлечь их из лунок. Затем с помощью пинцета возьмите две вставки из одной группы обработки за их верхние края и слейте содержимое на чистый абсорбирующий материал.

Затем погрузите вставки в первый стакан с DPBS, промывая ткани круговыми вращательными движениями в течение двух секунд. После этого поднимите вставки так, чтобы они были почти полностью заполнены DPBS, и слейте жидкость обратно в стакан. Повторите промывку в первом стакане дважды.

Затем таким же образом, как и после последнего промывания, промойте вставки в двух последующих стаканах с DPBS по 3 раза в каждом. Поверните каждую вставку под углом примерно 45 градусов открытым концом вниз и прикоснитесь верхним краем к абсорбирующему материалу, чтобы слить остатки DPBS. Затем немедленно погрузите ткани в 5 мл assay medium комнатной температуры.

По окончании периода погружения после замачивания слейте assay medium из заранее маркированного 12-луночного планшета и промокните вставки абсорбирующим материалом. Затем перенесите вставки в новый 6-луночный планшет, содержащий по 1 мл теплой assay medium в каждой лунке, и поместите планшеты в инкубатор для начала теста на жизнеспособность MTT. Перенесите вставки в 24-луночный планшет, содержащий 0,3 мл свежеприготовленного раствора MTT.

Перед переносом промокните вкладыши об абсорбирующий материал. Удалите все пузырьки воздуха, скопившиеся под вкладышами, и через три часа верните ткани в инкубатор, поместив дно вкладышей на абсорбирующий материал. Затем для экстракции нецветных жидких исследуемых объектов методом погружения поместите вкладыши в предварительно промаркированный 24-луночный планшет, содержащий по 2 мл соответствующего экстракционного раствора в каждой лунке; для экстракции твердых или жидких красителей методом без погружения следуйте соответствующим инструкциям.

Перенесите вставки в предварительно маркированный шестилуночный планшет, содержащий по 1 мл экстракционного раствора в каждой лунке. Затем герметизируйте планшеты с помощью термозапаивателя или парафильма для предотвращения испарения и проведите экстракцию на орбитальном шейкере в течение двух-трех часов при комнатной температуре, обеспечив осторожное перемешивание в конце погружной экстракции. Проколите ткани, после чего слейте жидкость из каждой вставки обратно в лунку, а затем утилизируйте вставки вместе с тканями.

Перемешайте раствор экстракта в каждой лунке и перенесите по две аликвоты каждого образца объемом 200 µL в соответствующие лунки заранее маркированного 96-луночного планшета, как показано на схеме в конце раздела по экстракции без погружения. Удалите вставки и ткани, не прокалывая их, и добавьте в каждую лунку один миллилитр экстрагирующего раствора. Тщательно перемешайте экстрагирующий раствор в лунках и, как было продемонстрировано ранее, перенесите по две аликвоты объемом 200 µL из каждого образца в соответствующие лунки заранее маркированного 96-луночного планшета.

Наконец, измерьте оптическую плотность образцов в 96-луночном спектрофотометре при длине волны 570 нм без использования референсного фильтра и внесите результаты в таблицу для расчета соответствующей жизнеспособности тканей. Учтите поправки на влияние исследуемого химического вещества, как указано в текстовом протоколе; в данном эксперименте представлены репрезентативные результаты теста на раздражение глаз, проведенного с 10 исследуемыми образцами, а также отрицательным и положительным контролем. Средняя оптическая плотность для отрицательного контроля, соответствующая 100% жизнеспособности тканей, составила 1,31; относительная жизнеспособность тканей для положительного контроля составила 31,2%. Исследуемые образцы 1, 2, 4, 7 и 8 продемонстрировали жизнеспособность тканей более 60%, что позволяет классифицировать эти образцы, а также образцы 3, 5, 6, 9 и 10, как нераздражающие.

С другой стороны, жизнеспособность тканей составила 60% или менее, что привело к их классификации как раздражителей. Разница в жизнеспособности между дубликатами тканей в данном эксперименте составила менее 20% для всех протестированных образцов, за исключением второго испытуемого образца. Таким образом, результаты для всех испытуемых образцов, кроме второго, были признаны достоверными, так как они соответствовали всем критериям приемлемости теста на раздражение слизистой оболочки глаза.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить тест DICATION с использованием четвертой модели реконструированной ткани, подобной роговице человека, in vitro, для маркировки химических веществ по идентификации опасности. Данная процедура была внедрена в руководства по тестированию EOC D в качестве части стратегии многоуровневого тестирования.