Анализ функциональной дополнительности (FCA): A Laboratory Упражнение Разработана и внедрена к дополнению Учение биохимических путей

Общая цель эссе о функциональном дополнении состоит в том, чтобы выяснить активность фермента путем введения функциональной копии соответствующего гена в мутантную клетку, чтобы увидеть, восстанавливает ли она фенотип дикого типа на мутантном фоне. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в самых разных областях, таких как биохимия, микробиология, генетика, биология растений, эволюция и другие. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она оценивает функцию, активность и/или роль фермента в условиях in vivo, которые обычно являются физиологическими по своей природе, в отличие от условий in vitro, которые обычно являются искусственными по своей природе.

Применение этого метода простирается на идентификацию и/или выяснение функции нехарактерных ферментов, а также тех, которые все еще имеют предполагаемые или предсказанные функции. Эту процедуру функционального дополнения демонстрирует специалист по биотехнологии и молекулярной биологии Тейлор Харкнесс, студент моей лаборатории. После клонирования генов DapL, TarB, MurE и RSH в соответствии с текстовым протоколом инокулируют 50 миллилитров жидкой среды одной колонией мутантных бактериальных клеток, которые трансформируются с помощью интересующего гена и выращиваются в течение ночи.

На второй день используйте 50 миллилитровую культуру на ночь, чтобы инокулировать 1 литр соответствующей среды и выращивайте при 30 градусах Цельсия до блокировочной фазы или до OD600 от 0,4 до 0,6. Соберите клетки центрифугированием при температуре 5 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем сцедите надосадочную жидкость и используйте 500 миллилитров стерильной, ледяной, дистиллированной воды для ресуспендирования гранул.

Снова центрифугируйте клетки, а после сцеживания надосадочной жидкости используйте 250 миллилитров стерильного, ледяного 10% глицерина для ресуспендирования гранулы. После вращения клеток в последний раз используйте два миллилитра 10% глицерина для ресуспендирования клеток. Перелейте 50 микролитров аликвот в микроцентрифужные пробирки и немедленно заморозьте, поместив пробирки в ванну с сухим льдом.

Храните элементы при температуре минус 80 градусов Цельсия для электропорации. Чтобы провести электропорацию, добавьте 1 микролитр рекомбинантной плазмиды в 50 микролитров грамотных клеток и положите на лед на пять минут. Перенесите элементы в электропорационную кювету и установите электропоратор на следующие настройки: емкость 25 градусов по Фаренгейту, 2,5 киловольта и сопротивление 200 Ом.

Затем с помощью кюветы в приборе подайте импульс. Добавьте в кювету 1 миллилитр восстановительной среды и перенесите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Дайте клеткам восстановиться, инкубируя культуру в встряхивающем инкубаторе с мягким вращением в течение 60 минут при температуре, необходимой мутанту.

Чтобы выбрать трансформанты, пипеткой нанесите 100 микролитров культуры на среду с агаровыми планшетами и используйте стерильный разбрасыватель для растекания раствора. Затем инкубируйте в течение ночи при соответствующей температуре. Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации.

Чтобы выполнить анализ комплементации, преобразуйте AOH1 с пустым вектором pBAD33 или с векторами экспрессии dapL с помощью электропорации, как показано выше. Нанесите смесь на агаровую среду LB с добавлением 50 мкг на миллилитр DAP, 34 мкг на миллилитр хлорамфеникола и 50 мкг на миллилитр канамицина. Инкубируйте планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов, прежде чем наблюдать за результатами.

С помощью пустого вектора pBAD33 или экспрессирующего вектора murE преобразуйте мутант TKL-11 с помощью электропорации, как было показано ранее в этом видео. Поместите трансформаторы на LB агар, добавленный 50 микрограммами на миллилитр тиамина и 34 микрограммами на миллилитр хлорамфеникола, и инкубируйте пластины при 30 градусах Цельсия в течение 24 часов перед проверкой на наличие трансформаторов. Тест на комплементацию путем нанесения полос или осаждения колоний из контрольной и экспериментальной трансформаций на две пластины среды LB, плюс 0,2% арабинозы и 50 микрограммов на миллилитр тиамина.

Инкубируйте одну пластину при 30 градусах Цельсия, а другую при 42 градусах Цельсия в течение 24 часов, прежде чем оценить фенотип роста. Трансформируйте мутантный штамм Hx699 и дикий штамм Rr217 видов novosphingobium с пустым вектором pRK290 или вектором, содержащим нативный ген rshNsp, в двух отдельных событиях трансформации, как было показано ранее в этом видео. Положите трансформанты на картофельную декстрозу или PD-агар с добавлением 10 мкг на миллилитр тетрациклина и инкубируйте не менее 72 часов, или до появления трансформантов.

Затем разрежьте трансформаторы по X-образной схеме на свежих пластинах PD-агара с тетрациклином. После инкубации при 30 градусах Цельсия в течение не менее четырех дней визуально изучите фенотип роста обеих пластин. Двойной мутант E.coli AOH1 содержит мутацию в гене DapE и делецию гена DapD, и не будет расти, если не будет предоставлен Dap.

Как видно из рисунка, мутант AOH1, экспрессирующий DapLs, способен расти на среде, свободной от LLDap, путем преобразования THDP в LLDap в пути лизирования Dap. Фермент MurE способствует добавлению m-DAP в пептидогликан грамотрицательных бактерий. Мутант E.coli MurE, TKL-11, не может расти при 42 градусах Цельсия.

В этом эксперименте только клетки TKL-11, преобразованные с помощью MurE, растут при температуре 42 градуса Цельсия. Мутация в гене TyrB препятствует синтезу тирозина и фенилаланина. Однако, как показано на рисунке, когда мутантный штамм TyrB DL39 экспрессирует ген A.thaliana At5g36160, он растет на среде M9, не имея тирозина и фенилаланина, демонстрируя, что фермент может синтезировать тирозин.

Мутант Hx699 у видов novosphingobium содержит нефункциональный белок RSH и продуцирует гипомукоидальный фенотип. Тем не менее, трансформация с помощью нативного гена RSH производит больше растворимых внеклеточных полисахаридов в многоклеточной X-полосе, которая является гипермукоидальной. Напротив, когда мутант Hx699 трансформируется с помощью пустого вектора, он производит гипомукоидальный фенотип.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 24-48 часов. При правильном выполнении, в зависимости от роста используемого модельного организма, за исключением клонирования, компетентности подготовительных и трансформационных этапов. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о требованиях к условиям роста мутантов, используемых в анализе функциональной комплементации.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как традиционная аксиоматическая характеристика in vitro, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфичность субстрата, температура и оптимума pH, скорость соматической скорости и так далее. После своего развития этот метод прокладывает путь исследователям в области биологии и многих других областей, таких как микробиология, для выяснения функции или роли ферментов различных организмов in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать электрокомпетентные бактериальные клетки, как трансформировать бактерии с помощью электропорации и как оценить функцию генов/ферментов с помощью функциональной комплементации.

Не забывайте, что работа с патогенными организмами может быть крайне опасной и следует соблюдать необходимые меры предосторожности.