Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в C. Элеганс
14 ноября 2016 г.
Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.
Общая цель этого протокола мутагенеза состоит в том, чтобы использовать простую светодиодную установку для мутагенизации геномной ДНК C.elegans, экспрессирующих зависимые от синего света активные белки-генераторы кислорода. Два основных преимущества этого метода заключаются в том, что протокол мутагенеза очень прост и не требует использования токсичных химикатов. И во-вторых, генератор мутагенеза доказывает свою эффективность после длительной мутации.
Сначала у меня появилась идея этого метода, и я понял, что белки, генерирующие АФК, никогда не использовались для индуцирования наследственных мутаций. Для этого эксперимента подключите контроллер светодиодного осветителя к цифровому генератору функций с помощью кабеля BNC. С помощью специального держателя закрепите светодиодные фонари на высоте 10 сантиметров над сценой.
Теперь частично накройте установку, чтобы ограничить воздействие синего света на окружающую среду, но не настолько, чтобы тепло не скапливалось на сцене. Здесь используется изготовленная на заказ жесткая пластиковая крышка с открытыми верхом и низом. Во время работы светодиода всегда надевайте солнцезащитные очки или солнцезащитные очки, потому что свет очень яркий.
Теперь переключите рычаг светодиодного контроллера на внутренний и установите его на 65% от его максимальной мощности. С помощью фотометра при необходимости отрегулируйте мощность света, чтобы на сцене она составляла 2,0 милливатт на квадратный миллиметр при непрерывном освещении. В соответствии с этим протоколом светочувствительный штамм должен поддерживаться в темноте в стандартных условиях.
Следует избегать ненужного воздействия света, но регулярное использование галогеновой лампы для прохода не приводит к мутациям. Поскольку случайная мутация является проблемой, замораживайте аликвоты штамма при их первом получении. Для мутагенеза приготовьте фильтровальную бумагу по размеру 60-миллиметровой пластины с квадратным отверстием примерно 25 миллиметров в центре, и положите ее на незасеянную пластину.
Затем равномернораспределите 100 микролитров 100 миллимолярного хлорида меди по фильтровальной бумаге, чтобы черви не покинули квадратное отверстие. Теперь из тарелки червей, которые находятся примерно через 12 часов после стадии L4, выберите гравидных молодых взрослых гермафродитов и поместите их в центральный квадрат на пластине. Далее включите светодиод и генератор функций.
Затем переключите светодиодный контроллер на внешний для управления им с помощью функционального генератора и установите соответствующую мощность. Из генератора функций создайте синусоидальную волну с частотой 4 Гц. Теперь перенесите тарелку на сцену и освещайте червей синим светом в течение 30 минут.
Сразу после обработки переложите всех здоровых на вид червей в засеянную тарелку. Эти черви после световой обработки будут казаться нескоординированными, но они выздоровеют. Держите обработанных светом червей в темноте.
Позже проверьте наличие аномальной морфологии или поведения у взрослого потомства F2. Прямой генетический скрининг проводили по описанной методике для 60 пластин F1, соответствующих 120 мутагенизированным гаплоидным геномам. Восемь из 60 пластин F1 с червями F2 демонстрировали видимые фенотипы, такие как неуклюжая форма тела, нескоординированные движения или летальность взрослого человека.
Потомство этих червей F2 сохранило эти наблюдаемые фенотипы. Количество видимых мутантов с этого экрана позволяет предположить, что штамм и его структура работают правильно для оптогенетического мутагенеза. Процедуру мутагенеза можно провести в течение часа.
Пожалуйста, наслаждайтесь быстрым и безопасным методом мутагенеза.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол мутагенеза с использованием генетически кодируемого гистон-miniSOG для индуцирования общегеномных наследуемых мутаций синезависимым способом. Этот метод является простым, быстрым и не требует применения токсичных химикатов, что делает его идеальным для прямого генетического скрининга и интеграции трансгенов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Нейронаука
- Мутагенез
Теоретические сведения
- Генетически кодируемые белки могут генерировать активные формы кислорода (АФК).
- Предыдущие методы индуцирования мутаций часто включали использование токсичных химических веществ.
- В данном исследовании изучается новый подход к наследуемому мутагенезу.
- В качестве модельного организма для данного протокола используются C. elegans.
Цель исследования
- Разработать простой протокол мутагенеза с использованием синего света.
- Продемонстрировать эффективность белков, генерирующих АФК, в индуцировании мутаций.
- Облегчить проведение прямого генетического скрининга и интеграцию трансгенов.
Используемые методы
- Использование простой установки на светодиодах для проведения мутагенеза.
- Подключение светодиодного осветителя к цифровому генератору функций.
- Фиксация светодиодных ламп над предметным столиком с помощью специального держателя.
- Наблюдение за эффектами мутагенеза у C. elegans.
Основные результаты
- Успешная индукция наследуемых мутаций в масштабе всего генома.
- Демонстрация нетоксичного метода мутагенеза.
- Валидация метода для прямого генетического скрининга.
- Потенциал интеграции трансгенов с использованием данного метода.
Выводы
- Данный протокол предлагает простой и эффективный подход к мутагенезу.
- Мутагенез, зависящий от синего света, является перспективным методом для генетических исследований.
- Этот метод может способствовать развитию исследований в области генетики и молекулярной биологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Оптогенетический случайный мутагенез с использованием гистон-miniSOG у C. elegans позволяет осуществлять быструю наследуемую модификацию генома без применения опасных химикатов, оптимизируя рабочие процессы на ранних этапах поиска. Данный подход поддерживает высокопроизводительный генетический скрининг и интеграцию трансгенов, снижая операционные барьеры и повышая гибкость исследовательского портфеля. Безопасность и простота делают этот метод масштабируемым инструментом для функциональной геномики и валидации мишеней в доклинических исследованиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает систематическое изучение функций генов с помощью прямого генетического скрининга.
- Способствует выявлению новых путей и генетических модификаторов, имеющих значение для моделей заболеваний.
- Поддерживает биологическое снижение рисков путем создания разнообразных аллельных вариантов для механистических исследований.
- Повышает прогностическую достоверность при выборе мишени за счет обеспечения непредвзятого мутагенеза.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированную, воспроизводимую систему для создания мутантных библиотек C. elegans.
- Исключает химические риски, упрощая стандартизацию анализа и соблюдение лабораторных норм.
- Позволяет быстро подготавливать генетически разнообразные популяции для последующего фенотипического скрининга.
- Поддерживает масштабируемые, готовые к внедрению рабочие процессы для оценки соединений и изучения генетических взаимодействий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует разработке релевантных моделей заболеваний, обеспечивая возможность направленного мутагенеза и интеграции трансгенов.
- Обеспечивает непрерывный переход от генетических открытий к доклинической валидации на модельных организмах.
- Способствует продвижению проектов с учетом рисков, предоставляя надежный генетический инструментарий для снижения рисков за счет изучения механизмов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод оптогенетического мутагенеза применяется на ранних стадиях поиска и валидации мишеней, обеспечивая идентификацию ведущих соединений и разработку доклинических моделей.
- Фундаментальная биология: ускоряет проверку гипотез и выяснение путей передачи сигналов с помощью непредвзятого мутагенеза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для отбора мутантов и фенотипического анализа.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение фенотипов мутантов и эффективности интеграции трансгенов.
- Трансляционные исследования: связывает генетические открытия с оптимизацией доклинических моделей на C. elegans.
- Повторное использование в масштабах предприятия: предоставляет многоразовую нетоксичную платформу для непрерывного генетического скрининга и разработки инструментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования и валидацию мишеней за счет обеспечения возможности широкого мутагенеза без влияния химических факторов.
- Эксплуатационная ценность: повышает безопасность в лаборатории, уровень стандартизации и пропускную способность за счет исключения опасных реагентов.
- Стратегическая ценность: способствует принятию эффективных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних стадиях благодаря надежным генетическим инструментам.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков и гибко развивать программы генетических исследований.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики C. elegans и настройки оптогенетических систем.
- Необходима инфраструктура светодиодного (LED) освещения и соблюдение базовых протоколов лабораторной безопасности при воздействии света.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Методика может быть адаптирована для других модельных систем с совместимыми оптогенетическими конструкциями.
- Требуется осторожное обращение во избежание непреднамеренных светоиндуцированных мутаций.
