Долгосрочный Живая съемка Drosophila Диски глаз

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы показать живое изображение имагинальных дисков, которые являются популярными экспериментальными объектами для изучения широкого спектра биологических явлений, включая пролиферацию клеток, дифференцировку, апоптоз и конкуренцию. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как морфология клеток и миграция в конкретных тканях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что непрерывная визуализация может показать больше информации, чем фиксированная ткань, например, миграцию клеток.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что рассечение и монтаж затруднены. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этап вращения и переноса трудно освоить, потому что неправильное рассечение приводит к низкому разрешению. Чтобы начать выполнение протокола, продезинфицируйте оборудование 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе.

Затем выберите личинку третьего возраста из флакона от мухи и промойте личинку в 1X фосфатно-солевом буфере или PBS, чтобы предотвратить заражение флаконом от мухи. Очищенную личинку поместите в один миллилитр питательной среды при комнатной температуре в девятилуночный стеклянный точечный планшет под микроскопом для вскрытия. Обхватите личинку парой щипцов на 1/3 пути от заднего конца, а другим щипцом возьмитесь за крючок для рта.

Потяните два щипца в противоположных направлениях, чтобы освободить внутренние ткани. Затем удалите слюнные железы, жировое тело и кутикулу из комплекса глаз-мозг, прикрепленного к крючку для рта. Если вентральный нервный канатик все еще прикреплен, отрежьте его ножницами.

Используйте одну пару щипцов, чтобы захватить крючок для рта. С помощью другой пары щипцов удалите ткань, соединяющую мозг и диски глаза в дорсальной области. Далее поверните весь комплекс так, чтобы подфюзеляжная сторона была обращена вверх.

Снимите нить, которая соединяет крючок или диск с мозгом. Затем снимите крючок для рта, стараясь не повредить глазной диск во время процесса. Глазной диск теперь свободен в среде и соединен с мозгом только оптическим стеблем.

Прикрепите двойной слой уплотнительных колец к центру покровного стекла размером 42 мм на 0,17 мм для удержания агарозы. Далее соберите камеру с покровным листом. Поместите чехол на акцептор сцены.

Затем поместите силиконовое уплотнительное кольцо на покровную крышку. Затем установите основание, заблокируйте уплотнительный шкафчик и установите крышку. С помощью микропипетки объемом 20 микролитров с наконечником объемом от 10 до 200 микролитров осторожно перенесите рассеченный комплекс глаз-мозг в центр уплотнительного кольца.

Удалите большую часть среды, и добавьте в образец 12 микролитров 0,7%-ной легкоплавкой, 37 градусов Цельсия. Вертикальный конец агара к образцу может удерживать ткань близко к покровному стеклу и избежать сползания образца. Добавьте один миллилитр питательной среды комнатной температуры в центр уплотнительного кольца.

Убедитесь, что агароза приклеена к уплотнительному кольцу, чтобы образец не дрейфовал. Поместите подготовленную камеру на предметный столик инвертированного конфокального микроскопа на 30 минут для выравнивания температуры. Перед долгосрочной визуализацией в реальном времени проверьте, не повреждена ли ткань, с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии.

Переключите объектив на 40x для изображения. Наконец, получение изображений Z-стека с глубиной волны 62 микрометра за 12 минут с оптическим интервалом в один микрометр. Проведите 40 циклов сканирования в общей сложности в течение 10 часов и убедитесь, что каждый цикл содержит 12 минут визуализации и три минуты отдыха.

R3 и R4 были помечены GFP. В начале 10-часового сеанса визуализации в реальном времени было восемь рядов омматидиальных кластеров, а в конце — 14 рядов омматидиальных кластеров. Основываясь на взаимном положении R3 и R4, омматидиальное вращение происходило в культивируемом диске ex vivo во время визуализации в реальном времени.

В начале ось R3/R4 кажется перпендикулярной экватору. Затем он поворачивается на 15 градусов за три часа, на 30 градусов за шесть часов и на 45 градусов за девять часов, что позволяет предположить, что этот метод может поддерживать дифференцировку фоторецепторов в течение 10 часов визуализации в реальном времени. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно препарировать диск глаза дрозофилы и проводить изображение в реальном времени.