Выделение микроглии из демиелинизирующих поражений мозга мыши с помощью магнитно-активированной сортировки клеток

Препарировать окрашенные демиелинизирующие поражения из мозолистого тела мозга мыши.

Эти поражения содержат резидентную в мозге микроглию, экспрессирующую интегрин клеточной поверхности CD11b.

Соберите ткань и добавьте раствор, содержащий протеолитический фермент и ДНКазу.

Фермент разрушает внеклеточный матрикс, в то время как ДНКаза разрушает свободную ДНК.

Добавьте холодный буфер и отфильтруйте суспензию через ситечко, чтобы удалить клеточные комки.

Центрифугуйте, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в среде с градиентом плотности.

Покрыть буфером и центрифугой собрать оставшийся мусор в верхних слоях, неповрежденные ячейки оседают на дне.

Удалите мусор и снова суспендируйте клетки в буфере.

Добавьте магнитные шарики, анти-CD11b, чтобы пометить микроглию.

Загрузите ячейки на колонку, содержащую ферромагнитные сферы, помещенные в магнитное поле магнитного сепаратора.

Под действием внешнего магнитного поля микроглии, связанная с шариками, удерживается в колонке, в то время как через нее протекают несвязанные клетки.

Извлеките колонку из магнитного поля. Добавьте буфер для размытия микроглии.

Начните с микрорассечения поражений, помеченных нейтральным красителем вокруг мозолистого тела, под стереомикроскопом. Центрифугируйте рассеченную ткань при давлении 300 x g в течение 30 секунд, чтобы собрать образец на дне пробирки. Разогрейте смесь ферментов 1 и смесь ферментов от 2 до 37 градусов Цельсия в инкубаторе. Затем добавьте 1 950 микролитров предварительно подогретой ферментной смеси 1 к одному образцу и переварите в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут. Добавьте 30 микролитров предварительно подогретой ферментной смеси 2 и аккуратно перемешайте.

После переваривания добавьте в тюбик 4 миллилитра холодного PBS, и осторожно встряхните. Центрифугируйте образцы тканей при давлении 300 x g в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия и медленно и полностью отсасывайте надосадочную жидкость. Мягко суспендируйте клеточную гранулу с помощью 1550 микролитров холодной PBS. Добавьте 450 микролитров холодного раствора для удаления мусора, и хорошо перемешайте.

Используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы очень медленно и аккуратно наложить смесь на 2 миллилитра холодной PBS. Центрифугируете, смешайте и затем найдите 3 слоя. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров для полной аспирации 2 верхних слоев, и заполните пробирку до 5 миллилитров буфером холодной загрузки. Аккуратно переверните трубку 3 раза.

Далее, после центрифугирования и аспирации надосадочной жидкости, повторно суспендируйте клеточную гранулу 90 микролитрами загрузочного буфера, и добавьте 10 микролитров гранул CD11b. Хорошо перемешайте и выдерживайте 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После инкубации добавьте 1 миллилитр загрузочного буфера и промойте клетки, аккуратно пипетируя жидкость вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1000 микролитров.

Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 минут при температуре 4:00 градусов Цельсия и полностью аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить несвязанные шарики. Суспендируйте ячейки в 500 микролитрах загрузочного буфера, и поместите колонку МС с ее сепаратором для положительного отбора в магнитном поле. Промойте колонку 500 микролитрами загрузочного буфера, чтобы защитить ячейки и обеспечить эффективность магнитной сортировки на основе протокола производителя.

Нанесите клеточную суспензию на столбец MS и выбросьте проточный поток, содержащий непомеченные клетки. Добавьте 500 микролитров загрузочного буфера для промывки колонны, и снимите ее с сепаратора. Поместите колонку на 15-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте в колонку 1 миллилитр загрузочного буфера. Наконец, нажмите на поршень в нижней части колонки, чтобы вымыть ячейки с магнитной маркировкой.