Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы внедрить оптимизированный метод окрашивания серебром для быстрого, простого и недорогого обнаружения маркеров SSR в неденатурирующих полиакриламидных гелях. Быстрое генотипирование маркеров SSR может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетических исследований и прикладной деятельности, такие как анализ генетического разнообразия и селекция с помощью маркеров в программах молекулярной селекции. Основными преимуществами этой методики является то, что она проста в проведении, занимает меньше времени и использует меньше химических реактивов, чем другие протоколы обнаружения маркеров SSR.

Этот метод позволяет избежать фиксации, остановки и нескольких этапов промывки, которые есть в обычных протоколах. И требует только двух основных этапов пропитки и пропитки. С помощью этого протокола можно получать четкие изображения без фонового шума для однозначного обнаружения паттернов полос SSR.

С помощью этого метода можно проводить скрининг около 800 образцов ДНК в день, и он успешно используется в исследованиях табака и цветущей китайской капусты. После приготовления ПЦР-продуктов и гелевых растворов согласно текстовому протоколу с помощью моющего средства в водопроводной воде промыть один комплект стеклянных пластин и распорок с последующим полным промыванием дистиллированной водой. Установите тарелки на решетку для сушки тарелок для сушки на воздухе.

Диспергируйте один миллилитр раствора Bind-силана на внутреннюю поверхность прямоугольной стеклянной пластины и высушите ее в течение пяти минут. Затем распылите один миллилитр Репел-силана на внутреннюю поверхность стеклянной пластины с насечкой с помощью тампона и с помощью папиросной бумаги вытрите излишки раствора, прежде чем дать пластине высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Соберите стеклянные пластины с распорками с выемкой сверху.

И используйте литейные зажимы для зажима с обеих сторон сборки. Затем налейте соответствующее количество 6% неденатурирующего раствора полиакриламидного геля в стакан для набора тарелок. Добавьте 20 микролитров TEMED и 200 микролитров свежего 20% APS и аккуратно перемешайте.

Немедленно и осторожно влейте раствор в собранные стеклянные пластины по краю надрезанной пластины, заполнив пространство почти доверху. И вставляем расческу. Затем нанесите небольшой объем гелевого раствора на расческу и дайте гелю застыть при комнатной температуре в течение 30 минут.

Когда гель полностью полимеризуется, снимите литейные зажимы и расположите пластину, установленную в блоке резервуара для электрофореза, пластиной с насечкой по направлению к верхнему буферному резервуару. Используйте большие зажимы для крепления набора пластин к блоку бака. Налейте по одному литру 0,5 X TBE буфера в каждую из верхней и нижней камер.

Затем снимите расческу и с помощью пипетки или шприца, наполненного буфером, тщательно промойте все лунки. Чтобы запустить полиакриламидный гель, загрузите около одного микролитра продукта ПЦР в каждую лунку. Кроме того, загрузите лестницу ДНК с обоих концов.

Затем закрепите предохранительную крышку на верхней буферной камере. Подключите провода к источнику питания, сопоставляя цветовую кодировку красного с красным и черного с черным. Запустите гель при постоянном напряжении 110 вольт, пока краситель не достигнет определенного положения.

Как правило, примерно на 70 минут. После электрофореза откройте клапан и слейте буфер из верхней камеры в большой стакан. Отсоедините боковые зажимы и снимите пластину с аппарата.

Затем с помощью шпателя осторожно отделите стеклянную пластину с насечкой с одной стороны и убедитесь, что гель остается прикрепленным к другой стеклянной пластине, покрытой Bind-силаном. Далее готовят один литр свежего раствора пропитки, растворив 1,5 грамма селитры серебра в одном литре дистиллированной воды. Затем приготовьте один литр свежего раствора для разработки, растворив 10 грамм гидроксида натрия в 900 миллилитрах дистиллированной воды.

Добавьте один миллилитр 37% формальдегида и используйте дистиллированную воду, чтобы довести конечный объем до одного литра. С помощью достаточного количества дистиллированной воды тщательно промойте гелевую и стеклянную пластину, чтобы удалить буфер для электрофореза. Затем поместите пластину с гелем лицевой стороной вверх в пластиковый лоток и погрузите гель в один литр раствора пропитки.

Аккуратно встряхивайте поднос на шейкере со скоростью 60 об/мин в течение трех-четырех минут. Переложите пластину из пропиточного раствора в другой лоток. Затем с помощью достаточного количества дистиллированной воды смойте остаточный раствор пропитки с поверхности пластины и геля два раза по три-пять секунд каждый.

Этап промывки гелем после пропитки имеет решающее значение. Недостаточное смывание моей причиной неполного удаления раствора пропитки. И в результате получается темный фон.

Поместите место гелем вверх в другой противень. Погрузите пластину в один литр раствора для проявки, затем осторожно встряхивайте лоток со скоростью 50 об/мин в течение примерно трех минут. Следите за появлением фрагментов ДНК и останавливайте развитие, когда наблюдается наибольшее соотношение сигнала фрагментов ДНК к шуму фона.

Подходящее время для разработки является еще одним ключевым шагом. Чрезмерное развитие может привести к появлению темно-коричневого фона с низким контрастом изображения фрагментов ДНК. Дважды промойте пластину и гель достаточным количеством дистиллированной воды и высушите гелевую пластину с помощью папиросной бумаги.

Затем с помощью сканера и соответствующего программного обеспечения отсканируйте гель с разрешением 300 DPI и отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы получить четкую визуализацию полос ДНК. Наконец, оцените полосатость маркеров SSR на основе размеров фрагментов ДНК на изображении. Представленные здесь ампликоны ПЦР были получены с использованием соответствующих пар праймеров SSR в цветущей пекинской капусте и табаке.

После электрофореза полиакриламидные гели окрашивали с использованием протокола окрашивания серебром, продемонстрированного в этом видео. Что однозначно выявило полосчатые паттерны маркеров SSR. Для сравнения эффективности обнаружения различных протоколов окрашивания серебра продукты ПЦР маркеров SSR были разделены с помощью PAGE и визуализированы с помощью пяти опубликованных протоколов окрашивания серебра и шестого метода, продемонстрированного в этом видео.

Продемонстрированный здесь протокол имел самый низкий уровень фонового шума и самый высокий контраст фрагментов ДНК, что позволило получить высочайшую четкость изображения. Из шести протестированных протоколов продемонстрированный здесь метод занимает наименьшее количество времени и требует наименьшего количества химических реагентов и технологических операций. Наконец, на этом рисунке показана чувствительность протокола, измеренная с помощью последовательного разведения маркера ДНК от 50 до 2000.о. на неденатурирующем полиакриламидном геле от 10 нанограммов на полосу на первой дорожке до 9,8 пикограмм на полосу ДНК на первой дорожке.

После освоения этой техники ее можно выполнить за семь минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о предотвращении перекрестного загрязнения пропиточных и проявочных растворов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к быстрому генотипированию маркеров SSR.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как просто и эффективно обнаружить маркеры SSR в неденатурирующем полиакриламидном геле с помощью окрашивания серебром. Не забывайте, что работа с химическими реактивами может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать такие меры предосторожности, как перчатки.