Лямбда выбрать cII мутации системы обнаружения

Общая цель этого протокола заключается в визуализации пошаговых процедур, задействованных в анализе мутации Lambda Select cII в культивируемых клетках трансгенных грызунов или соответствующих животных, обработанных химическими и физическими агентами, представляющими интерес. Этот метод тестирования может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования мутаций, такие как: является ли тестируемое соединение мутагенным? И если да, то насколько он является мощным мутагеном?

Вызывает ли он секвенс-специфичные мутации? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является минимальным практически любым тестовым соединением. Метод может быть использован для тестирования мутагенности в клетках млекопитающих с использованием хромосомно интегрированного репортерного гена.

Чтобы получить реакцию на одну упаковку, добавьте пять микрограммов геномной ДНК в микроцентрифужную пробирку, содержащую первую реакционную смесь. Затем инкубируйте трубку при температуре 30 градусов Цельсия в течение 90 минут. После инкубации добавьте в пробирку 12 микролитров второй реакционной смеси и оставьте еще на 90 минут при температуре 30 градусов Цельсия.

Через 90 минут добавьте в тюбик 1,1 миллилитра буфера SM. Затем энергично перебейте пробирку с упакованной ДНК при комнатной температуре в течение примерно 10 секунд. Быстро дайте импульсный открут в микроцентрифуге.

Затем оставьте тюбик на льду до использования. Далее добавьте 50 микролитров хлороформа на каждый миллилитр упакованной ДНК. Если образец не будет обработан в тот же день, то аккуратно обработайте образец вихрем и храните при температуре четыре градуса Цельсия до двух недель.

Подготовьте 16 стерильных пробирок с круглым дном и 16 агаровых пластин TB1 для одного упакованного образца ДНК. Используйте десять пробирок для просеивания и шесть для титрования. Затем добавьте 300 микролитров гальванической культуры G1250 в каждую пробирку с круглым дном.

Далее для титрования добавляем 10 микролитров упакованной ДНК к 990 микролитрам буфера SM и разведение 1:100. Затем сделайте образец вихревым. Добавьте по 20 или 100 микролитров раствора ДНК 1:100 в каждую из трех пробирок титра 20 или титра 100 соответственно.

Для скрининга добавьте 100 микролитров неразбавленного упакованного образца ДНК в каждую из 10 пробирок для скрининга. Обработайте все 16 пробирок для титрования и просеивания. Сделайте трубки вихревыми в течение 10 секунд, чтобы перемешать компоненты.

Затем инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы кишечная палочка-хозяин впитала фаги. Далее добавляем 2,5 миллилитра расплавленного TB1 верхнего агара. Поддерживайте температуру 55 градусов Цельсия до соответствующих титрирующих и просеивающих трубок.

После добавления сразу же аккуратно закрутите трубки. Теперь насыпьте агар TB1 на соответствующий титр или экранирующую пластину с агаром TB1. Дайте тарелкам постоять от 15 до 30 минут при комнатной температуре.

Как только агар застынет, переверните и оставьте все 10 просеивающих пластин в стационарном инкубаторе при температуре 24 градуса Цельсия на 46-48 часов. Оставшиеся шесть титровых пластин оставьте в стационарном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на ночь или сутки. После инкубации при температуре 37 градусов Цельсия подсчитайте количество образовавшихся бляшек на всех пластинах титра 20 и титра 100.

После инкубации при температуре 24 градуса Цельсия подсчитайте количество бляшек, образовавшихся в 10 просеивающих планшетах. Чтобы проверить предполагаемые мутантные бляшки, стержневую бляшку с помощью стерильного наконечника пипетки с широким отверстием. Затем перенесите бляшку в стерильную микроцентрифужную пробирку, заполненную 500 микролитрами стерильного буфера SM.

Затем инкубируйте микроцентрифужную пробирку при комнатной температуре не менее двух часов при комнатной температуре. Затем смешайте один микролитр стержневого фагового раствора с 200 микролитрами гальванической культуры G1250 в стерильной пробирке с круглым дном. Затем выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 30 минут.

Через 30 минут поместите раствор фага с сердцевиной в 2,5 миллилитра расплавленного верхнего агара TB1 и инкубируйте при температуре 24 градуса Цельсия в течение 46-48 часов. Как только вторичные бляшки станут видимыми, используйте наконечник пипетки, чтобы выбрать одну хорошо изолированную мутантную бляшку Lambda cII. Перенесите налет в микроцентрифужную пробирку, наполненную 25 микролитрами двойной дистиллированной воды в пипетке несколько раз.

Оставьте тюбик на кипящей воде на пять минут. Затем центрифугируйте пробирку при 18 000 умноженных на G в течение трех минут при комнатной температуре. Сразу после центрифугирования переложите 10 микролитров надосадочной жидкости в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 40 микролитров мастер-смеси для ПЦР.

После амплификации ПЦР очистите параамплифицированный продукт 432 с добавлением гена cII и его фланкирующих областей с помощью набора для очистки ПЦР. Затем секвенируйте трансген cII с помощью анализатора ДНК для обнаружения мутаций. Бляшки, полученные на пластинах титра 20 и титра 100, хорошо видны, если держать их рядом с белым световым коробом и на темном фоне.

Здесь на графике бара показана мутагенная активность различных химических веществ в испытуемых физических соединениях. Это делается путем анализа степени увеличения относительной частоты мутанта cII, выделенного из бластов эмбриональных волокон мыши. На гистограмме изображены все эти тестовые реактивы, показывающие статистически значимое увеличение частоты мутанта cII.

Далее демонстрируются спектры мутаций трансгена cII в бластах эмбриональных волокон мыши, облученных UVB. Круговая диаграмма показывает значительное увеличение относительной частоты перехода одиночного или тандемного цитидина в тимидин при пиримидинуклеотидах по сравнению с контролем. После освоения эта техника может быть выполнена за восемь-десять часов, если она выполнена правильно, исключая время подготовки пластины с бактериальными полосами при культивировании.

При секвенировании ДНК после оценки мутантов cII. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить анализ мутаций тестируемого соединения в модельной системе in vitro.