Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши

Этот метод может быть полезен гематологам и иммунологам, изучающим продукцию и функцию миелоидных клеток, включая нейтрофилы, моноциты и дендритные клетки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет более точно идентифицировать субпопуляции миелоидных предшественников по сравнению с предыдущими стратегиями. Чтобы обогатить клетки костного мозга для предшественников с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток, или MACS, гранулируйте клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулу в 40 микролитрах окрашивающего буфера MACS из расчета 10 умножить на семь клеток костного мозга.

Чтобы истощить дифференцированные линии-позитивные клетки, добавьте 10 микролитров коктейля антител к биотину в расчете на 10 раз к семи клеткам и перемешайте пипетированием в течение 10-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации добавьте 30 микролитров окрашивающего буфера из расчета «один умножить на 10» на семь клеток с перемешиванием, а затем 20 микролитров микрогранул антибиотина в расчете «один умножить на 10» на семь клеток. Через 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия промойте клетки одним миллилитром буфера для окрашивания в соотношении от 10 до 7 клеток и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах свежего буфера для окрашивания в количестве до 10 до 10 до восьми клеток.

Далее настройте автоматический магнитный сепаратор в соответствии с инструкциями производителя и поместите в сепаратор пробирку с маркированными ячейками. Запустите программу отрицательного отбора для сбора отрицательной фракции, содержащей прогенитор обогащенных линией отрицательных клеток. Гранулируйте негативные клетки линии центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу, которая теперь белого цвета, в двух миллилитрах буфера для окрашивания на каждую мышь для подсчета.

Чтобы изолировать миелоидные клетки-предшественники с помощью FACS, добавьте один раз по 10 к пятым линиям отрицательных клеток в каждую из восьми контрольных микроцентрифужных пробирок для выбора напряжения и цветовой компенсации, а остальную часть образца клеток добавьте в девятую микроцентрифужную пробирку для окрашивания всеми семью поверхностными маркерными антителами, представляющими интерес для идентификации и сортировки предшественников. Гранулируют клетки центрифугированием и ресуспендируют контрольные гранулы в 100 микролитрах буфера для окрашивания FACS и экспериментальный образец гранул в 100 микролитрах буфера для окрашивания из расчета от пяти до 10 до шести клеток. Затем добавьте антитела к CD16/CD32 в пробирку с одним окрашивателем Fc-гамма-рецептора и пробирку с образцом.

в вихрь и инкубируйте образцы в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации добавляют другие антитела в соответствующие пробирки с одиночным окрашиванием и в пробирку с образцом и после осторожного перемешивания инкубируют образцы в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации добавьте 900 микролитров красящего буфера в контрольные пробирки и один миллилитр окрашивающего буфера в соотношении 10 раз в семь клеток в пробирку для образцов центрифугирования.

Ресуспендируйте контрольные гранулы в 200 микролитрах свежего окрашивающего буфера на пробирку и экспериментальную гранулу по 500 микролитров в 2,5 раза по 10 на семь клеток и перенесите меченые ячейки в отдельные соответствующие пятимиллилитровые пробирки FACS. Затем настройте проточный цитометр в соответствии со стандартными протоколами и используйте неокрашенный и одинарный элементы управления для установки напряжения и цветовой компенсации. Чтобы идентифицировать и изолировать миелоидные клетки-предшественники, загрузите образец экспериментальной клетки на цитометр и создайте график прямой области рассеяния против боковой зоны рассеяния, стробируя для исключения мусора и мертвых клеток.

Создайте график зависимости высоты прямого рассеяния от ширины прямого разброса активных ячеек и вентиля, чтобы исключить дублеты. Повторите этот процесс с диаграммой зависимости высоты бокового рассеяния от ширины бокового рассеивания синглетов и затвора прямого рассеивания, чтобы исключить дублеты. Создайте график Sca-1 в сравнении с c-Kit и затвор для выбора положительных предшественников c-Kit Sca-1 отрицательных.

Затем создайте график и гейт для сравнения CD-34 и FC-гамма-рецепторов для выбора смешанных популяций общего миелоидного предшественника и смешанного гранулоцитарного моноцитарного предшественника. Важно как можно точнее определить популяции смешанного общего миелоидного предшественника и смешанного гранулоцитарного моноцитарного предшественника. Для более точного стробирования может быть полезно использовать график псевдоплотности цвета или контурный график

Используйте клетки в смешанных затворах общего миелоидного предшественника для создания графика CD115 против Flt3 и ворот для выбора общих миелоидных предшественников Flt3-положительных CD115 низких клеток, общих миелоидных предшественников Flt3-отрицательных CD115 низких клеток и Flt3-положительных предшественников CD115 с высоким уровнем моноцитарных дендритных клеток. Используйте клетки в затворе-предшественнике моноцитов смешанных гранулоцитов для создания графика рецептора Ly6C против FC Gamma и ворот для выбора Ly6C-отрицательных клеток и Ly6C-положительных клеток. Затем создайте график сравнения CD115 и Flt3 для каждой субпопуляции клеток-предшественников моноцитов со смешанными гранулоцитами и гейтируйте Ly6C-отрицательные Flt3-отрицательные CD115-низкогранулоцитарные моноцитарные предшественники, Ly6C-положительные Flt3-отрицательные CD115-низкогранулоцитарные предшественники и Ly6C-положительные Flt3-отрицательные предшественники CD115 с высоким содержанием моноцитов.

Максимальное истощение линии эффективно для истощения дифференцированных клеток и обогащения для c-Kit положительных клеток-предшественников. Линейно-отрицательная фракция все еще содержит некоторые c-Kit отрицательные клетки, но эти клетки будут удалены на последующих этапах стробирования проточной цитометрии. Выход предшественника после сортировки FACS может варьироваться в зависимости от используемых настроек сортировщика, но должна быть возможность получить от одной до четырех раз по 10 до четвертой клетки на фракцию от каждой мыши с чистотой после сортировки более 95% для каждой фракции.

Хорошее окрашивание имеет решающее значение для четкого разделения популяций. Возможно, вам придется титровать антитела или выбрать другие флуорофоры, чтобы обеспечить оптимальное разделение. Этот протокол может быть использован для идентификации клеток-предшественников, для оценки различий в составе костного мозга между образцами, для выделения предшественников для молекулярного анализа или для оценки их способности продуцировать миелоидные клетки.