Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

Наша лаборатория уже много лет использует метод проволочного миографа для измерения сократительной способности гладких мышц сосудов. Мы используем эту методику для изучения механизма сокращения гладкой мускулатуры. Мы используем этот метод для изучения новых препаратов для терапии гипертонии.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что сегмент сосуда выживает не менее четырех часов после установки и сохраняет сократительную способность, вызванную высоким содержанием калия, в течение многих раз. Многоканальная система дает возможность высокотерапевтического скрининга новых препаратов. Приколите тело усыпленной мыши брюшком вверх и смочите брюшную полость 70% этанолом.

Затем, разрезав ножницами кожу вдоль вентральной средней линии от паха, сделайте разрезы вниз по каждой ноге от начала первого разреза. Оттяните кожу назад с обеих сторон, затем сделайте аналогичные надрезы, чтобы открыть брюшину. Далее с помощью ножниц разрежьте пищевод, толстую кишку и другие соединительные ткани, чтобы полностью изолировать желудочно-кишечный тракт с питающей сосудистой сетью от организма.

После промывки крови из желудочно-кишечного тракта раствором HEPES-Tyrode или H-T переведите изолированный сегмент в покрытую покрытием чашку Петри для диссекции брыжеечной артерии при комнатной температуре. Разгладьте живот, тощую кишку, подвздошную кишку и слепую кишку по часовой стрелке и прижмите живот и слепую кишку слева и справа соответственно. Включите просвечивающий источник света стереоскопического микроскопа и зафиксируйте кишечник булавками, чтобы обнажить рассеченные брыжеечные артерии.

щипцами жировые ткани вокруг артерий и аккуратно изолируют артерии, отрезая все соединительные ткани ножницами для вскрытия. Захватите лишнюю артерию щипцами, пересадите и погрузите дерево брыжеечной артерии в холодный раствор H-T, не содержащий ионов кальция. Отрежьте участок артерии диаметром 1,4 миллиметра проксимальнее стенки кишечника брыжеечной аркады и с помощью двух щипцов осторожно вскройте обе стороны этого сегмента артерии.

Подготовьте два отрезка проволоки из нержавеющей стали длиной 2,5 сантиметра и поместите их в одну посуду. С помощью щипцов аккуратно зажмите один конец артерии. Затем с помощью других щипцов аккуратно вставить два провода в просвет артерии один за другим.

Следите за тем, чтобы провода держались ровно и не касались эндотелия. С помощью двух щипцов зажмите оба провода снаружи продетого сосуда одновременно и осторожно перенесите сосуд из чашки Петри в камеру миографа, заполненную раствором H-T. Отвинтите губки камеры в стороны, чтобы освободить место для крепления, затем возьмитесь за обе стороны одного из двух вставленных проводов с помощью двух щипцов и поместите сосуд в щековую щеку.

Оберните обе стороны зажатой проволоки вокруг винтов подсоединенной к микрометру губки. Зафиксируйте левый винт, повернув его по часовой стрелке. Затем с помощью щипцов выпрямите проволоку.

Далее закрепите правосторонний винт, повернув по часовой стрелке. Следите за тем, чтобы сосуд всегда находился внутри щелевой щели, но не прикасайтесь к челюсти во избежание повреждения. Закройте две челюсти с помощью микрометра.

Убедитесь, что две челюсти находятся достаточно близко, но не касаются друг друга, и что незакрепленный провод находится поверх неподвижного провода. С помощью правых щипцов аккуратно сложите открученный провод в углу губки, подключенной к преобразователю силы, и оберните его по часовой стрелке вокруг винта с правой стороны. Затем зафиксируйте винт.

Повторите разворачивание и обмотку левой стороны провода и фиксируйте левый боковой винт. Затем слегка раздвиньте губки, не растягивая сосуд, осторожно вращая микрометр так, чтобы зазор между двумя челюстями мог вместить только два провода. Затем с помощью щипцов переместите проволоку со стороны микрометра к горизонтальной плоскости проволоки со стороны преобразователя.

После монтажа артерий в других камерах подключите все камеры к оборудованию и накройте камеры. Подключите источник 100% кислорода и датчик температуры и начните нагревать до 37 градусов Цельсия. Откройте программу для построения графиков.

Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать запись. Выберите интересующий канал в меню DMT, чтобы открыть окно нормализации DMT для соответствующего канала. Введите в окно следующие постоянные значения:Конечные точки тканей a1, 0.1; Конечные точки тканей a2, 4; Диаметр проволоки, 40.

Затем в окне отображается рассчитанная длина сосуда как 1,40 миллиметра. Считайте микрометр соответствующей тканевой камеры. Введите значение в поле чтения микрометра и нажмите кнопку «Добавить точку».

Это значение является начальным значением X. После 60-секундной задержки в окне отображается сила и эффективное давление, соответствующие этому микрометрическому значению. Одновременно с этим блок считывания микрометра становится активным. Растягиваем нормируемый сосуд, поворачивая микрометр против часовой стрелки.

Введите значение микрометра в поле чтения микрометра и нажмите кнопку «Добавить точку». Снова подождите время задержки в 60 секунд. Продолжайте растягивать сосуд и добавлять микрометрические значения, пока в окне не отобразится значение микрометра X-one, которое является расчетной микрометрической установкой, необходимой для растяжения сосуда до его IC-one.

Установите микрометр на значение X-one. После нормализации уравновесить сосуд в камере в течение 15 – 20 минут. После уравновешивания проведите испытание сосуда раствором с высоким содержанием калия, заменив раствор H-T на 5 миллилитров раствора с высоким содержанием калия, чтобы вызвать сокращение в течение 10 минут.

Повторив 10-минутную инкубацию в свежем растворе с высоким содержанием калия, промыть пятью миллилитрами раствора H-T три-четыре раза. Снова проведите испытание сосуда пятью миллилитрами раствора с высоким содержанием калия, чтобы вызвать сокращение. Через пять минут добавьте в камеру 0,5 микролитра стокового раствора неолиенсинина, чтобы расслабить сосуд при конечной концентрации одного микромоля неолиенсинина.

Когда сила стабилизируется через несколько минут, добавьте еще 0,5 микролитра стокового раствора неолиенсинина, чтобы увеличить концентрацию до двух микромоляров. Добавляйте по одному микролитру стокового раствора каждый раз, чтобы увеличить концентрацию до четырех, шести, восьми и 10 микромоляров для создания кривой зависимости от дозы. Во время процедуры нормализации сосуд растягивался несколько раз до достижения значения IC-100, и каждый растянутый цикл включал в себя сильное сокращение, быстрое расслабление и поддержание силы в течение 60 секунд.

Сокращение гладкой мускулатуры сосудов, вызванное раствором с высоким содержанием калия, обычно проявлялось в двух фазах: сильной фазе и устойчивой фазе. Описан метод измерения изометрической сократительной способности брыжеечной артерии мыши с помощью многопроводной системы миографа. Этот метод может быть использован для оценки функций гладкой мускулатуры сосудов и для скрининга релаксантов гладкой мускулатуры.

Основное отличие этого способа от других заключается в этапах монтажа. Этот шаг, используемый здесь, прост в выполнении и не повреждает ткани или устройство. После этой процедуры другие стимуляторы, такие как ЭП и ангиотензин II, также могут быть использованы для стимуляции сокращения гладких мышц, чтобы найти некоторые новые препараты, чувствительные к этому агонисту.