Рассечение и выделение мышиной глии из нескольких областей центральной нервной системы

Этот протокол важен, потому что мы узнаем, что глии регионально неоднородны, морфологически, функционально и генетически. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете изучить три отдельные подгруппы глии из четырех различных областей центральной нервной системы. Демонстрировать эту процедуру буду я и Рэйчел Тинки, аспирантка моей лаборатории.

С помощью тонких ножниц разрежьте кожный слой по средней линии головы щенка, начиная каудально и двигаясь рострально до рыла. Избегайте глубоких разрезов в черепе, чтобы предотвратить повреждение тканей. Наклонив голову вниз, потяните кожный слой к каждой стороне черепа и с помощью пружинных ножниц сделайте надрез по средней линии черепа, начиная с большого затылочного отверстия.

Раздвиньте половинки черепа щипцами с тонкими наконечниками, обнажая кору головного мозга, мозжечок и ствол мозга. После обнажения осторожно извлеките мозг из черепа и поместите его в 10-сантиметровую чашку Петри с 10 миллилитрами PBS и раствором антибиотика. Убедитесь, что мозг остается неповрежденным с прикрепленным задним мозгом.

Отщипните мозжечок с помощью щипцов с тонкими изогнутыми наконечниками. Поместите в специальную коническую пробирку объемом 15 миллилитров на льду. Отделите средний мозг от коры головного мозга.

Удалите мозговые оболочки коры головного мозга и поместите их в специальную коническую пробирку. Ткань должна быть тщательно осмотрена, чтобы обеспечить полное удаление мозговых оболочек. Если менингеальные клетки остаются в культуре, они могут нанести вред росту глиальных клеток.

Чтобы расчленить спинной мозг, поместите его вентральной стороной вверх и с помощью тонких пружинных ножниц разрежьте позвонки, чередуя левую и правую стороны, пока ткань спинного мозга не обнажится. Аккуратно удалите спинной мозг и мозговые оболочки и поместите их в специальную коническую трубку на льду. Добавьте по одному миллилитру 0,05%-го трипсина с 0,53 миллимолярной ЭДТА в каждую пробирку с тканью.

Растирайте смесь с помощью пипетки объемом 10 миллилитров примерно 20 раз. Затем переложите клеточную суспензию в пустую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Инкубируйте раствор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 15 минут.

Осторожно взбалтываем лизаты через восемь минут. После инкубации добавьте пять миллилитров MGM и 200 микролитров DNase I по одному в каждую пробирку до конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр. Измельчите каждый лизат 10 раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров.

Затем дайте клеточной суспензии постоять в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы недиссоциированная ткань осела на дне трубки. Перенесите клеточные суспензии в новые 50 миллилитровые конические пробирки, оставив позади недиссоциированную ткань. После центрифугирования повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах MGM и растирайте ее 20 раз. Поместите клеточные суспензии на покрытые колбы T25 и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Смените среду через 24 часа, чтобы удалить остатки клеток. Чтобы провести выделение клеток-предшественников олигодендроцитов, встряхните клетки в течение 15 часов, затем извлеките надосадочную жидкость из колбы и положите ее на стерильную чашку Петри. Инкубируйте надосадочную жидкость при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут.

Взболтайте через 15 минут, чтобы удалить остатки микроглии. Удалите неадгезивную клеточную надосадочную жидкость, подсчитайте клетки и нанесите их на поверхность, покрытую поли-D-лизином, в желаемой концентрации. Верните клетки в инкубатор минимум на один час.

Затем осторожно отсасывайте 95% среды и медленно добавляйте теплую среду OPC, пипетируя ее у стенки лунки, чтобы свести к минимуму разрушение OPC. С помощью этого метода было продемонстрировано, что передача сигналов гамма-интерферона влияет на дифференцировку и созревание OPC. Без рецептора интерферона гамма, корковые OPC не дифференцируются в зрелые миелинизирующие олигодендроциты, говорит легко, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания MBP.

Также была проанализирована экспрессия GFAP. Клетки с дефицитом гамма-интерферона сильно экспрессируют GFAP, что позволяет предположить, что они могут принимать астроцитарный фенотип. О региональной гетерогенности в клетках ЦНС свидетельствует различная морфология астроцитов в коре, мозжечке, стволе головного мозга и спинном мозге.

Астроциты из одной и той же области также могут проявлять морфологическую гетерогенность, что подтверждает идею о том, что этот глиальный подтип является высокодинамичным. Также были изучены регионарные ответы OPC на дифференциальную стимуляцию цитокинами. Передача сигналов цитокинов существенно влияет на поведение стволовых и иммунных клеток и может влиять на то, как OPC дифференцируются в зрелые миелинизирующие олигодендроциты.

Следующие регионарные клетки выделения глиальных клеток могут быть использованы в различных экспериментальных условиях и с использованием нескольких методов, включая иммуногистохимию, количественную ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинг.