Рассечение и выделение мышиной глии из нескольких областей центральной нервной системы
4 июня 2020 г.
Здесь мы представляем протокол выделения in vitro множественных популяций глиальных клеток из ЦНС мыши. Этот метод позволяет проводить сегрегацию регионарной микроглии, клеток-предшественников олигодендроцитов и астроцитов для изучения фенотипов каждого из них в различных культуральных системах.
Этот протокол важен, потому что мы узнаем, что глии регионально неоднородны, морфологически, функционально и генетически. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете изучить три отдельные подгруппы глии из четырех различных областей центральной нервной системы. Демонстрировать эту процедуру буду я и Рэйчел Тинки, аспирантка моей лаборатории.
С помощью тонких ножниц разрежьте кожный слой по средней линии головы щенка, начиная каудально и двигаясь рострально до рыла. Избегайте глубоких разрезов в черепе, чтобы предотвратить повреждение тканей. Наклонив голову вниз, потяните кожный слой к каждой стороне черепа и с помощью пружинных ножниц сделайте надрез по средней линии черепа, начиная с большого затылочного отверстия.
Раздвиньте половинки черепа щипцами с тонкими наконечниками, обнажая кору головного мозга, мозжечок и ствол мозга. После обнажения осторожно извлеките мозг из черепа и поместите его в 10-сантиметровую чашку Петри с 10 миллилитрами PBS и раствором антибиотика. Убедитесь, что мозг остается неповрежденным с прикрепленным задним мозгом.
Отщипните мозжечок с помощью щипцов с тонкими изогнутыми наконечниками. Поместите в специальную коническую пробирку объемом 15 миллилитров на льду. Отделите средний мозг от коры головного мозга.
Удалите мозговые оболочки коры головного мозга и поместите их в специальную коническую пробирку. Ткань должна быть тщательно осмотрена, чтобы обеспечить полное удаление мозговых оболочек. Если менингеальные клетки остаются в культуре, они могут нанести вред росту глиальных клеток.
Чтобы расчленить спинной мозг, поместите его вентральной стороной вверх и с помощью тонких пружинных ножниц разрежьте позвонки, чередуя левую и правую стороны, пока ткань спинного мозга не обнажится. Аккуратно удалите спинной мозг и мозговые оболочки и поместите их в специальную коническую трубку на льду. Добавьте по одному миллилитру 0,05%-го трипсина с 0,53 миллимолярной ЭДТА в каждую пробирку с тканью.
Растирайте смесь с помощью пипетки объемом 10 миллилитров примерно 20 раз. Затем переложите клеточную суспензию в пустую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Инкубируйте раствор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 15 минут.
Осторожно взбалтываем лизаты через восемь минут. После инкубации добавьте пять миллилитров MGM и 200 микролитров DNase I по одному в каждую пробирку до конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр. Измельчите каждый лизат 10 раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров.
Затем дайте клеточной суспензии постоять в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы недиссоциированная ткань осела на дне трубки. Перенесите клеточные суспензии в новые 50 миллилитровые конические пробирки, оставив позади недиссоциированную ткань. После центрифугирования повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах MGM и растирайте ее 20 раз. Поместите клеточные суспензии на покрытые колбы T25 и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Смените среду через 24 часа, чтобы удалить остатки клеток. Чтобы провести выделение клеток-предшественников олигодендроцитов, встряхните клетки в течение 15 часов, затем извлеките надосадочную жидкость из колбы и положите ее на стерильную чашку Петри. Инкубируйте надосадочную жидкость при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут.
Взболтайте через 15 минут, чтобы удалить остатки микроглии. Удалите неадгезивную клеточную надосадочную жидкость, подсчитайте клетки и нанесите их на поверхность, покрытую поли-D-лизином, в желаемой концентрации. Верните клетки в инкубатор минимум на один час.
Затем осторожно отсасывайте 95% среды и медленно добавляйте теплую среду OPC, пипетируя ее у стенки лунки, чтобы свести к минимуму разрушение OPC. С помощью этого метода было продемонстрировано, что передача сигналов гамма-интерферона влияет на дифференцировку и созревание OPC. Без рецептора интерферона гамма, корковые OPC не дифференцируются в зрелые миелинизирующие олигодендроциты, говорит легко, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания MBP.
Также была проанализирована экспрессия GFAP. Клетки с дефицитом гамма-интерферона сильно экспрессируют GFAP, что позволяет предположить, что они могут принимать астроцитарный фенотип. О региональной гетерогенности в клетках ЦНС свидетельствует различная морфология астроцитов в коре, мозжечке, стволе головного мозга и спинном мозге.
Астроциты из одной и той же области также могут проявлять морфологическую гетерогенность, что подтверждает идею о том, что этот глиальный подтип является высокодинамичным. Также были изучены регионарные ответы OPC на дифференциальную стимуляцию цитокинами. Передача сигналов цитокинов существенно влияет на поведение стволовых и иммунных клеток и может влиять на то, как OPC дифференцируются в зрелые миелинизирующие олигодендроциты.
Следующие регионарные клетки выделения глиальных клеток могут быть использованы в различных экспериментальных условиях и с использованием нескольких методов, включая иммуногистохимию, количественную ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинг.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол выделения in vitro нескольких популяций глиальных клеток из центральной нервной системы (ЦНС) мыши, включая региональную микроглию, клетки-предшественники олигодендроцитов и астроциты. Методология позволяет изучать специфические фенотипы каждого типа глиальных клеток в различных культуральных системах, подчеркивая их региональную гетерогенность.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология глиальных клеток
Теоретические основы
- Глиальные клетки проявляют региональную гетерогенность в морфологии, функциях и генетике.
- Понимание особенностей различных популяций глиальных клеток имеет решающее значение для изучения их роли в ЦНС.
- Данный протокол позволяет исследователям изучать взаимодействие различных типов глиальных клеток.
- Изоляция отдельных популяций может дать представление об их специфическом вкладе в функционирование ЦНС.
Цель исследования
- Разработать метод выделения специфических популяций глиальных клеток из различных отделов ЦНС.
- Изучить фенотипические характеристики выделенных популяций глии.
- Исследовать региональные реакции клеток-предшественников олигодендроцитов на стимуляцию цитокинами.
Используемые методы
- Для выделения глиальных клеток использовалась методика культуры клеток in vitro.
- Биологическая модель включает глиальные клетки, полученные из фрагментов ЦНС мыши.
- Мультиомиксные рабочие процессы не упоминались.
- Основные этапы включают диссекцию, трипсинизацию и методы подготовки клеточной суспензии.
- Для достижения оптимальных результатов были указаны временные интервалы инкубации и высева клеток.
Основные результаты
- Протокол позволил успешно выделить отдельные популяции глиальных клеток из разных отделов ЦНС.
- В исследовании было отмечено, что сигнализация интерферона гамма влияет на дифференцировку клеток-предшественников олигодендроцитов.
- Астроциты демонстрировали морфологическую гетерогенность в зависимости от отдела ЦНС, из которого они были выделены.
- Были освещены возможные следствия для понимания того, как цитокинная сигнализация влияет на поведение глиальных клеток.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует ценный метод изучения роли глиальных клеток в функционировании ЦНС.
- Благодаря возможности изоляции специфических подмножеств глии исследователи могут лучше понять их уникальный вклад.
- Данный протокол служит основой для будущих исследований динамики глиальных клеток и их реакции на внешние стимулы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Региональная гетерогенность глиальных клеток влияет на валидацию мишеней и снижение механистических рисков при разработке лекарственных препаратов для ЦНС. Данный протокол позволяет выделять микроглию, клетки-предшественники олигодендроцитов и астроциты из четырех областей ЦНС мыши для обеспечения фенотипического скрининга и разработки анализа. Предоставляя релевантные заболеванию системы с определенным клеточным составом, данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей и оптимизирует стратегии идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать фенотипы подмножеств глиальных клеток в областях коры, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга для уточнения биологии мишени и снижения рисков при проверке механистических гипотез.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимое выделение микроглии, OPC и астроцитов для проведения последовательных исследований по взаимодействию с мишенью и модуляции сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать регионально определенные культуры глии для скрининга соединений и оценки цитокин-опосредованных эффектов на дифференцировку и созревание OPC.
- Практическая ценность: Стандартизирует подготовку глии с помощью механической диссоциации и высева на определенный матрикс для обеспечения готовности к анализу и масштабируемости.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет оценивать региональные глиальные ответы на интерферон гамма и другие цитокины, что способствует уточнению биомаркеров и определению патофизиологической значимости.
- Практическая ценность: Позволяет использовать системы кокультивирования и культуры одного типа клеток для моделирования глиально-нейрональных взаимодействий и оценки результатов воздействия на мишени в рамках доклинических исследований.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, обеспечивая получение валидированных популяций глии для валидации мишеней, разработки анализов и снижения механистических рисков до этапа идентификации ведущих соединений.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез о региональной гетерогенности глии и путях передачи цитокиновых сигналов при модуляции мишеней в ЦНС.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных суспензий глии с определенным клеточным составом для воспроизводимого скрининга соединений и фенотипического анализа.
- Аналитика: позволяет проводить количественные измерения дифференцировки глии, экспрессии маркеров (например, MBP, GFAP) и функциональных ответов на стимуляцию цитокинами.
- Трансляционные исследования: связывают региональные фенотипы глии с системами, имеющими значение для патологий, что поддерживает принятие решений о продвижении разработок с учетом рисков в доклинических моделях.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую платформу для изоляции глии, применимую для различных областей ЦНС и экспериментальных условий для долгосрочного использования в R&D.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации глиальных мишеней за счет устранения механистической неопределенности и получения данных о функциональных особенностях конкретных регионов.
- Операционная ценность: Стандартизированные рабочие процессы диссоциации, посева и сепарации клеток обеспечивают воспроизводимость и масштабируемость в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Обоснование решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем уточнения взаимодействия с глиальной мишенью и снижения биологических рисков на поздних стадиях программ по ЦНС.
- Влияние на портфель: Обеспечение приоритизации мишеней с поправкой на риск на основе данных о региональном глиальном фенотипе и профилей цитокинового ответа.
Особенности реализации
- Для выделения областей ЦНС и удаления мозговых оболочек без контаминации требуются навыки в области нейроанатомии и стерильной диссекции тканей.
- Для диссоциации, посева и экспансии глии необходим доступ к центрифугам, дозаторам, CO2-инкубаторам и культуральным колбам с покрытием.
- Стандартизация протоколов трипсинизации, обработки DNase и тритурации между группами исследователей обеспечивает стабильный выход и жизнеспособность глиальных клеток.
- Адаптация к альтернативным модельным системам (например, глии, полученной из иПСК человека) требует валидации региональных маркеров и эффективности диссоциации.
- Ограничения включают необходимость быстрой обработки тканей для сохранения целостности глии и предотвращения избыточного разрастания клеток мозговых оболочек в культуре.
