Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Общая цель этой процедуры заключается в количественном определении циркулирующих микроРНК и биологических жидкостей, таких как плазма или сыворотка, с использованием технологии капельной цифровой ПЦР. Метод может помочь ответить на вопрос в сфере биомаркета. Путем выявления диагностического и прогностического, биомаркетингового рака.

Основное преимущество данной методики заключается в высокой чувствительности. Он может быть использован для количественного определения менее распространенных микроРНК без необходимости андрогинного референсного гена. Применение этого метода распространяется на диагностику рака, поскольку он имеет потенциал для выявления людей с раком на ранней стадии.

Он также может применяться при других заболеваниях, таких как неврологические или сердечные расстройства. Как правило, людям необходимо обращать внимание на манипуляции с каплями до этапа термоциклирования, чтобы избежать их разрушения. Следовательно, визуальная демонстрация генерации капель имеет решающее значение, поскольку капли могут быть уничтожены небрежными манипуляциями или слишком быстрым пипетированием.

Начните эту процедуру с выделения микроРНК плазмы или сыворотки крови. Затем перепишите и разбавьте их, как описано в сопроводительном документе. Достаньте набор праймеров микроРНК EvaGreen master mix и кДНК из морозильной камеры и дайте им оттаять при комнатной температуре.

После того, как он оттает, несколько раз переверните трубку основного микса. А затем раскрутите все реагенты. Приготовьте капельный цифровой или ddPCR смешанный рабочий раствор в соответствии с инструкцией в сопроводительном документе.

Подготовьте до восьми образцов без шаблонного контроля для каждого условия плюс превышение 10% После сборки тщательно перемешайте и уменьшите смесь ddPCR. Отметим, что технические репликации не требуются благодаря высокой воспроизводимости данной технологии. После отжима дозируйте по 12 микролитров смеси ddPCR в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета.

Добавьте в каждую лунку по восемь микролитров разбавленной матрицы кДНК. Затем вставьте картридж с генератором капель в держатель картриджа. На средний ряд картриджа с генератором капель аккуратно перенесите по 20 микролитров каждого подготовленного образца.

Избегайте попадания пузырьков воздуха на дно колодца. Заполните каждую из нефтяных скважин в нижнем ряду 70 микролитрами масла-генератора капель. Зацепите прокладку за держатель картриджа.

Вставьте в генератор капель и закройте крышку, чтобы начать генерацию капель. Когда генерация капель завершится, откройте крышку, извлеките картридж из генератора капель и снимите одноразовую прокладку. Верхние отверстия картриджа содержат капли.

Медленно и плавно переведите по 40 микролитров из каждой из восьми верхних лунок в одну колонку 96-луночного ПЦР-планшета. Сразу же запечатайте пластину фольгой, чтобы избежать испарения. В течение 30 минут после запечатывания планшета начните термоциклирование с использованием протокола ПЦР, описанного в таблице 3 сопроводительного документа.

Включите считыватель капель. Затем переместите пластину из термоамплификатора в считыватель капель. Поместите 96-луночный ПЦР-планшет, содержащий капли после ПЦР, в основание держателя планшета в считывателе капель.

Поместите верхнюю часть держателя планшета на планшет для ПЦР. С усилием нажмите на оба выступа, чтобы зафиксировать ПЦР-планшет в держателе. Запустите программное обеспечение QuantaLife с системного ПК. Нажмите кнопку Настройка и откройте файл данных шаблона, содержащий информацию о образцах, целевых генах и анализах.

На панели навигации слева выберите Выполнить. Появится окно «Параметры выполнения». В меню «Набор красителей» выберите «EVA» и нажмите «ОК», чтобы начать чтение капель.

После завершения прогона используйте график 2D амплитуды в программном обеспечении для анализа, чтобы выбрать положительные капли. Чтобы выбрать положительные капли, используйте инструмент лассо на левой панели навигации. Далее нажмите на вкладку «События», чтобы проверить количество положительных и общее количество дроплетов.

Общее количество капель обычно достигает 18 000 с помощью ddPCR без зонда. Затем нажмите на вкладку «Концентрация», чтобы визуализировать окончательный образец концентрации. Наконец, используйте кнопку Экспорт.

CSV для экспорта значений концентрации микроРНК. МРНК miR-181a-5p количественно определяли в двух образцах плазмы, S1 и S2, с использованием 0,5 и одной концентрации праймера в одном микролитре при температурах отжига 58 и 60 градусов Цельсия. На этом рисунке представлены копии микроРНК на микролитр в реакции амплификации для каждого состояния.

ПЦР-положительные капли для каждого образца показаны синим цветом, а отрицательные — черным. Как видно на рисунке, контрольный образец не содержит положительных капель, как ожидалось. Проведение ПЦР при температуре 60 градусов Цельсия с использованием 0,5 или одного микролитра праймера привело к лучшему разделению положительных и отрицательных капель.

На этом рисунке полосы погрешностей представляют 95%-ный доверительный интервал Пуассона. И здесь количество положительных капель, показанных синим цветом, сравнивается с общим количеством капель, показанных зеленым цветом. В совокупности эти данные демонстрируют, что капельная цифровая ПЦР может быть использована для определения абсолютного числа копий микроРНК на микролитр биологической жидкости.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как проводить количественное определение мРНК с помощью капельной цифровой ПЦР. После освоения 96 образцов могут быть проанализированы всего за несколько часов, что является оптимальным результатом для клинических условий. После каждой разработки этот метод прокладывает путь в область жидкостной биопсии для изучения микроРНК и других нуклеиновых кислот в качестве биомаркеров заболеваний.