Оптическая визуализация на основе фотодиода для записи динамики сети с разрешением одного нейрона у непрозрачных беспозвоночных

В этой статье представлено подробное описание того, как использовать матрицу фотодиодов и чувствительные к напряжению красители для одновременной регистрации потенциалов действия от большого числа нейронов. По сравнению с кальциевой визуализацией нейронной активности, которая является косвенной, потенциал-чувствительные красители, которые мы используем, регистрируют потенциалы действия, непосредственно похожие на резкие электродные записи, но на многих нейронах одновременно. Наш рабочий процесс оптической визуализации может быть адаптирован для быстрой визуализации сетевой активности с разрешением одного нейрона и одного действия в различных нетрансгенных беспозвоночных и даже позвоночных системах.

Кроме того, процедуры в нашем протоколе будет демонстрировать Эван Хилл из моей лаборатории. Начните с обезболивания 40-граммового животного Aplysia californica и приколите его брюшной стороной вверх в чашке для вскрытия, покрытой воском виде. Используя ножницы для вскрытия, сделайте разрез по средней линии в два-три сантиметра вдоль самой передней части стопы и прикрепите лоскуты стопы по обе стороны от разреза, чтобы выявить часть центральной нервной системы и буккальное образование.

Используйте щипцы и препарирующие ножницы, чтобы аккуратно рассечь буккальное образование, обнажив мозговые ганглии, и перерезать нервы, иннервирующие тело животного, чтобы иссечь центральную нервную систему, оставив большую длину нерва для стимуляции. С помощью мельчайших булавок расположите центральную нервную систему в заполненной солевым раствором чашке, покрытой эластомером, и перфузируйте чашку физиологическим раствором, пропущенным через охлаждающее устройство Пельтье, чтобы поддерживать температуру приготовления на уровне от 15 до 16 градусов Цельсия. С помощью щипцов и ножниц для микродиссекции удалите излишки соединительной ткани из нервов и рассеките поверхностную часть влагалища на ганглии или ганглиях, которые необходимо изобразить.

Затем опустите очищенную центральную нервную систему в раствор 0,5% глутаральдегида в физрастворе на 20 секунд, прежде чем вернуть центральную нервную систему в посуду, выстланную эластомером, чтобы смыть излишки глутаральдегида. Для приготовления рабочего раствора потенциал-чувствительного красителя добавьте 500 микролитров физиологического раствора к заранее приготовленной твердой аликвоте RH 155 до достижения конечной концентрации красителя 0,3 миллиграмма на миллилитр. И используйте ручной микродозатор, чтобы загрузить 200 микролитров раствора в кусок полиэтиленовой трубки с диаметром, аналогичным диаметру ганглия, который нужно окрашивать.

С помощью микроманипулятора осторожно поместите конец трубки над целевым ганглием, опуская трубку до тех пор, пока она не образует плотное уплотнение над ганглием. Поворачивайте ручку аппликатора микродозатора каждые пять минут в течение часа, чтобы увеличить количество красителя на ганглий, проверяя образец через 30 минут, чтобы убедиться в достаточном окрашивании. После окрашивания, приглушенный свет, поместите соответствующий буферный материал слева и справа от того места, где препарат будет помещен в камеру визуализации, содержащую физиологический раствор, а затем погрузите центральную нервную систему в камеру.

Прижмите к ткани кусок покровного стекла подходящего размера и сильно надавите на покровное стекло, чтобы расплющить ткань без повреждения нейронов. Затем поместите камеру визуализации под препарирующий микроскоп. Если вы стимулируете нерв для запуска фиктивной двигательной программы, осторожно расплавьте сегмент полиэтиленовой трубки PE100 над пламенем, осторожно потянув за оба конца сегмента трубки, и разрежьте полученную конусность в нужной точке.

Далее прикрепите отрезок толстостенной гибкой полимерной трубки к заднему концу полиэтиленового всасывающего электрода. Затем используйте ротовую часть для создания отрицательного давления и втяните небольшой объем физиологического раствора через конический конец всасывающего электрода. Втяните конец стимулируемого нерва в электрод под микроскопом и убедитесь, что в физрастворе электрода отсутствуют пузырьки, которые могли бы прервать электрическую проводимость.

Для визуализации ганглия переместите камеру в установку для визуализации и инициируйте перфузию физиологическим раствором через записывающую камеру. Поместите температурный зонд рядом с препаратом и установите температуру, соответствующую изображаемому виду. Поместите одну хлоридированную серебряную проволоку вниз по всасывающему электроду, убедившись, что она контактирует с физиологическим раствором в электроде, и поместите проволоку из хлорида серебра в солевой раствор ванны рядом с всасывающим электродом.

Опустите погружную линзу в солевой раствор и закройте базовую диафрагму. Поднимите или опустите подкаскадный конденсатор и отрегулируйте фокус до тех пор, пока края диафрагмы не окажутся в резком фокусе, создавая подсветку Kohler. Сосредоточьтесь на области препарата, подлежащего изображению, и получите изображение интересующего ганглия с помощью парфокальной цифровой камеры.

Установите переключатель усиления панели управления в положение 1X и нажмите кнопку интенсивности света покоя, чтобы проверить среднюю интенсивность света покоя диодов. Отрегулируйте уровень напряжения, подаваемого от стимулятора на блок питания светодиодной лампы, и продолжайте проверять средний уровень интенсивности света в состоянии покоя, пока он не окажется в нужном диапазоне. Затем установите переключатель усиления панели управления на 100X для записи и дважды проверьте, что пружина или воздушный стол плавающие.

Когда индикаторы по-прежнему приглушены, установите длину файла, путь и имя в программном обеспечении для обработки изображений и нажмите кнопку «Взять данные», чтобы получить файлы в объеме, не превышающем объем доступной оперативной памяти компьютера. Следите за тем, чтобы оставаться неподвижным во время записи, так как небольшие вибрации могут внести большие артефакты в оптические данные записи. Чтобы просмотреть данные сразу после сбора, используйте функцию наложения данных, собранных всеми 464 диодами, на изображение ганглия и щелкните любой из диодов, представленных в программном обеспечении, чтобы развернуть записанные данные на отдельном экране трассировки.

Чтобы добиться точного выравнивания диодов по отношению к препарированию, введите коэффициенты X, Y и увеличения, определенные по результатам теста с точечным отверстием. Чтобы максимизировать видимость потенциала действия и улучшить выход нейронов для последующей сортировки спайков, установите полосовой фильтр Баттерворта с пятью и 100 Гц срезами для удаления как низкочастотных, так и высокочастотных шумов. Чтобы сохранить отфильтрованные оптические данные в виде текстового файла для последующего анализа, на экране страницы выберите поле фильтра TP.

И на вкладке вывода выберите Сохранить страницу как ASCII. Затем введите соответствующее имя файла в появившемся диалоговом окне. Контакт кожи с морским звездчатым хищником запускает побег Tritonia diomedia, состоящий из ритмичной серии сгибаний всего тела, которые отбрасывают его в безопасное место.

На этом рисунке показаны необработанные и отфильтрованные данные с 20 диодов, регистрирующих активность до, во время и после стимуляции трех нервов педалей. Сразу после регистрации сигналы, измеренные всеми 464 диодами регистрирующей матрицы, могут быть топографически отображены на изображении препарата в программном обеспечении для обработки изображений. В этом анализе спайковая сортировка отфильтрованных диодных трасс с помощью анализа независимых компонент (ICA) дала 53 уникальных нейронных трассы, 30 из которых показаны здесь.

Сильно аверсивный хвостовой стимул для Aplysia californica вызывает повторяющиеся волны двухчастной ритмической реакции убегания, состоящей из периода галопа из нескольких циклов выпадов головой и тяг хвостом, которые быстро перемещают животное вперед, и последующего периода ползания. В этом репрезентативном анализе через одну минуту непрерывной 20-минутной оптической записи девятый нерв педали стимулировали, чтобы вызвать последовательность моторной программы галопа-ползания. Вероятностное гауссово пространственное распределение сигналов от всех 81 зарегистрированных нейронов было отображено на ганглии.

Уменьшение размерности применительно к полной записи показало, что фазы галопа и ползания программы побега занимали различные области и формировали различные траектории в пространстве главных компонент. При использовании этого протокола важные соображения включают в себя: оптимизацию окрашивания, минимизацию вибрации и направление достаточного количества света через препарат к PDA при минимизации фотообесцвечивания красителя. Примеры анализа после сбора данных, который позволил получить представление о сети на уровне популяции, включают обнаружение функционального ансамбля с помощью кластеризации консенсуса в алгоритме неконтролируемого обучения и уменьшение размерности с помощью анализа главных компонент.

Сочетание нашей системы визуализации на основе матрицы фотодиодов и использования поглощающих сильночувствительных красителей позволяет отслеживать динамическую эволюцию сети в течение длительного периода времени.