Картирование абсолютной плотности ДНК в ядрах клеток с помощью микроскопии локализации одиночных молекул

Настоящий метод позволяет измерять абсолютную плотность ДНК в ядрах клеток для исследования пространственных ограничений в структурах хроматина, которые в противном случае характеризуются только посттрансляционными модификациями гистонов. Тесселяция Вороного в сочетании с SMLM позволяет оценить абсолютную плотность ДНК в соотношении пары оснований на квадратный микрометр. Единственное, что необходимо знать априори, — это общее содержание ДНК в измеряемом ядре клетки.

В будущих экспериментах было бы интересно выяснить, коррелируют ли абсолютные различия плотности с биологической информацией, полученной от других методов, таких как иммунофлуоресценция эпигенетических модификаций или данные Hi-C. Начните с реконструкции отсканированной области, соединив предварительно записанные отдельные изображения вместе. Откройте CellProfiler и загрузите конвейер cellcycleanalysis.cpproj.

На первом шаге изображения конвейера перетащите изображения, включая эталонное изображение. Далее определите местоположение, где будут храниться опорные изображения. Затем нажмите на значок «Начать тестовый режим», а затем «Выполнить».

После отображения гистограммы ядер на анализируемом изображении определите интервалы интенсивности для фаз G1, S и G2 и убедитесь, что они введены в последующие шаги фильтрации объекта конвейера и что эти шаги активны. Затем нажмите кнопку «Выполнить» еще раз, чтобы продолжить работу со второй половиной конвейера. Посмотрите на три изображения с наложениями, представляющими различные стадии клеточного цикла, G1, S или G2, и выберите ядра в G1 или G2 для дальнейшей визуализации, чтобы было известно количество ДНК в парах оснований ядер изображения.

Переместите клетки на микроскоп локализации одной молекулы и обеспечьте правильное мигание процесса FPALM. Сначала запишите 3D-стек выбранного ядра, используя всего 500 кадров на срез. Это позволяет определить относительное количество ДНК в средней части, которая позже визуализируется с помощью многих других кадров, чтобы выявить ее ультраструктуру.

Начните съемку серии изображений с выдержкой 50 миллисекунд, в результате чего частота кадров составит примерно 20 кадров в секунду. Проведите Z-стек через ядро с шагом 200 нанометров и всего 500 кадров на световой оптический участок. После того, как стек был получен, вернитесь в исходную позицию z и получите основной набор данных из 50 000 кадров с тем же временем экспозиции 50 миллисекунд.

Откройте набор данных FPALM в ImageJ. Чтобы оптимизировать настройки для обнаружения мигающих сигналов, нажмите на ThunderSTORM, затем Run analysis. Теперь выберите «Настройка камеры».

Введите правильный размер изображения в пикселях, количество аналого-цифровых характеристик, квантовую эффективность используемой камеры, базовый уровень и усиление ЭМ, затем нажмите OK. Выберите алгоритм определения координат локализации путем подгонки мигающих сигналов. В разделе Фильтрация изображений используйте вейвлет-фильтр B-Spline с порядком B-сплайна 3 и шкалой B-сплайна 2. Затем установите для параметра Метод приблизительной локализации молекул значение Локальный максимум, для параметра Порог пиковой интенсивности и для параметра Связность значение 8-окрестностей.

В разделе Субпиксельная локализация молекул в качестве Метода выберите интегрированный Гауссов PSF, установите Радиус подгонки px на 3, выберите Метод подгонки как Максимальное правдоподобие и установите Начальную сигму на 1.6. Затем нажмите OK, чтобы начать обнаружение сигналов и восстановление изображения. Если получение данных секционируется по разным стекам изображений, объедините таблицы локализации в ThunderSTORM.

Для этого нажмите «Импорт» во всплывающем окне. Убедитесь, что параметр Добавить в текущую таблицу активирован и что используется правильный начальный номер, чтобы избежать переопределения локализаций в таблице. Затем выберите путь к файлу и нажмите OK, чтобы импортировать один файл за другим.

Чтобы предотвратить чрезмерный подсчет сигналов в последовательных кадрах, объедините данные локализации, используя максимальное расстояние 20 нанометров, 1 максимальное отклонение кадра и максимальное количество кадров 0 кадров на молекулу, затем нажмите кнопку Объединить. Чтобы измерить и скорректировать смещение путем перекрестной корреляции подразделов данных, откройте меню Коррекция смещения и щелкните стрелки. Добавьте 3 ячейки и установите Увеличение на 5.

Затем нажмите «Применить», и появится окно, показывающее смещение x и y. Чтобы определить количество сигнала, пропорциональное содержанию ДНК в каждом срезе предварительно записанного 3D-стека с 500 кадрами для каждого среза, выберите «Плагины», затем «ThunderSTORM», а затем «Импорт/экспорт» и импортируйте таблицу результатов для первого среза стека. Чтобы избежать чрезмерного подсчета сигналов от других плоскостей изображения 3D-стека, сигналы из-за пределов 200-нанометрового интервала по z между срезами необходимо удалять.

Нажмите Построить гистограмму и в открывшемся диалоговом окне Распределение выберите z и нажмите OK. Определим положение пика и с помощью поля фильтра выберем сигналы с оптическим шагом 200 нанометров. Нажмите «Визуализация» и выберите опцию «Гистограммы», затем нажмите «ОК». Сохраните полученное изображение в папке в формате TIFF. Откройте все срезы и объедините их с помощью Изображения, затем Стопок, а затем Изображений в стопку.

Выбрав всю область изображения, перейдите в раздел «Анализ», нажмите «Инструменты» и выберите «Менеджер ROI». Нажмите «Добавить», затем нажмите «Анализ», затем «Установить измерения» и выберите «Интегрированная плотность». Теперь выберите опцию Еще, выберите Мультимер, установите флажок Измерить все стопки, а также Одна строка на срез.

Нажмите OK, и появятся результаты. Сумма интенсивностей всех срезов пропорциональна содержанию ДНК всего ядра точно так же, как интенсивности отдельных срезов пропорциональны их доле всего генома. Открыв таблицу результатов центральной плоскости, содержащей сигналы 50 000 кадров, отфильтруйте ее до толщины 100 нанометров.

Создайте гистограмму полученных сигналов, как было показано ранее, и измерьте интегрированную плотность центрального сечения. Преобразуйте большую таблицу локализации ThunderSTORM, содержащую информацию об ультраструктурах из центрального сечения, из формата csv в формат ORTE с помощью скрипта MATLAB TS2orte. m, который преобразует таблицу локализации в матрицу MATLAB и сохраняет ее в формате mat.

Заходим в папку LAND-voronoi, а в подпапке coreAlgorithm открываем файл voronoicluster. m и скорректировать содержание ДНК, долю наблюдаемого центрального участка всей фракции ядра ДНК и локализаций, а также коэффициент преобразования в соответствии с используемым типом клетки и стадией клеточного цикла для расчетов абсолютной плотности. Редактируем сценарий, который запускает анализ voronoi.m.

Настройте путь к файлам для данных локализации orte и папку вывода для файлов результатов. Укажите координаты, определяющие область, в которой должна быть выполнена тесселяция. Определите несколько областей для вычисления в одном входном наборе данных.

После запуска скрипта найдите изображение, показывающее абсолютную плотность ДНК, вместе с другими файлами, содержащими графики, показывающие гистограмму распределения площади и плотности. m, содержащий плотности каждой отдельной вычисляемой ячейки Вороного в выходной папке. Измерение FPALM, состоящее из 50 000 кадров, дало результат в 2,68 умножить на 10 в степени 6 обнаруженных локализаций в пределах промежуточной части толщиной 100 нанометров.

Точность локализации восстановленного изображения составила 10 нанометров. Большое количество локализаций позволило сочетать визуализацию со сверхвысоким разрешением и демонстрацию абсолютной плотности ДНК. Было очевидно, что измеренные плотности ДНК не были равномерно распределены по ядру и охватывали обширный динамический диапазон.

Более высокие увеличения областей внутри ядра, показывающие более крупные клетки Вороного, указывали на низкую плотность ДНК, в то время как меньшие клетки указывали на высокую плотность ДНК. Плотность ДНК, измеренная в G1C3H10T половине ядра, показала абсолютное распределение плотности ДНК в ядре другого типа и вида. Хотя базовая организация выглядела как раннее ядро G1 HeLa, оно дополнительно обладало конститутивными кластерами парацентрического гетерохроматина.

В ядре G2 не наблюдалось никаких драматических архитектурных изменений, несмотря на несколько увеличенный размер ядра. Ядро HeLa, обработанное TSA, показало заметные различия в отношении ядерной топографии и плотности ДНК. За исключением периферического гетерохроматина, который показал островки более высокой плотности ДНК, остальная часть хроматина выглядела гораздо более однородной и деконденсированной.