Многометный протокол микроскопии локализации одной молекулы для исследования хроматина в плотной ядерной среде
June 5th, 2026
Мы представляем протокол окрашивания и анализа с использованием трёхцветной хроматиновой мономолекулы (SMLM), который позволяет воспроизводимо картировать эухроматина, гетерохроматина и RNAP II для пространственного анализа. Этот протокол обеспечивает эффективную многоцветную маркировку в плотных ядерных средах, включая мишени, связанные с хроматином, что обеспечивает надёжное одновременное обнаружение.
Наши исследования изучают эпигенетический состав доменов упаковки хроматина и то, как регулирующие факторы формируют их структуру и функцию. Этот протокол наиболее полезен для изучения пространственных связей между целями и плотными клеточными средами, такими как ядро. Для начала взвесьте бычий сывороточный альбумин, чтобы конечная концентрация в необходимом буферном объёме для эксперимента составляла 3%. Добавьте бычий сывороточный альбумин в центрифугную трубку.
Наклоните трубку центрифуги под углом 45 градусов, чтобы распределить кристаллы альбумина из сыворотки крупного рогатого скота, затем добавьте PBS в трубку. Это предотвращает слипание кристаллов. Позвольте всем кристаллам альбумина в сыворотке крупного рогатого рогатого скота естественным образом растворяться при комнатной температуре и избегайте встряхивания или вихря.
Когда кристаллы полностью растворятся, добавьте Triton X-100 для достижения конечной концентрации 0,2%. Если кристаллы остаются, пипетировать раствор вверх и вниз несколько раз, чтобы медленно перемешивать без образования пузырей. Возьмите живые клетки из инкубатора. Удалите клеточную культурную среду из тарелки.
Промывайте клетки, добавив достаточно PBS, чтобы покрыть их, а затем пипеткой вытащите PBS. Далее пипеткой нанесите достаточно фиксирующего раствора, чтобы покрыть клетки, и оставьте их фиксироваться на 10 минут. Используя весы, взвесьте борогидрид натрия, чтобы приготовить раствор для закалки 0,1%.
Добавьте борогидрид натрия в центрифугную трубку. Вытащите фиксирующий раствор из блюда пипеткой. Затем добавьте достаточно PBS в тарелку, чтобы покрыть поверхность ячейки.
Поставьте блюдо на шейкер на пять минут, чтобы промыть клетки. Далее добавьте необходимый объём PBS в боргидрид натрия в трубке центрифуга. Закрутите трубку, чтобы смешать раствор для закалки.
Снимите блюдо из шейкера и выбросьте PBS из тарелки. Добавьте достаточно раствора для закалки, чтобы покрыть поверхность блюда. Затем поставьте блюдо на шейкер на семь минут, чтобы закалить автофлуоресценцию в клетках.
Оставшийся раствор для закалки в трубке центрифуги выложите в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов. Снимите блюдо из шейкера, а затем уберите раствор для закалки. Затем добавьте достаточно PBS в тарелку, чтобы покрыть поверхность.
Поставьте блюдо на шейкер на пять минут, чтобы промыть клетки. После инкубации удалите PBS и повторите стирку с PBS ещё два раза. Теперь добавьте достаточно блокирующего буфера в тарелку, чтобы покрыть поверхность.
Инкубировать блюдо на шейкере не менее одного часа, чтобы проникнуть клеточные мембраны и заблокировать сайты связывания. Для подготовки раствора для окрашивания первичного антитела перенесите необходимый объём буферного материала в новую трубку центрифуга. Добавьте необходимый объём первичного антитела в блокирующий буфер для достижения конечной концентрации, указанной производителем.
Затем замените блокирующий буфер достаточном количеством раствора первичного антитела, чтобы покрыть поверхность блюда и инкубировать на шейкере в течение одного-двух часов или на ночь. После инкубации первичных антител замените раствор первичного антитела на буфер для промывания. Затем поставьте блюдо на шейкер на пять минут, чтобы промыть клетки.
Повторите буферную стирку ещё два раза, всего три раза. Приготовьте вторичный раствор для окрашивания антител в соответствии с рекомендуемой концентрацией. Рассчитайте общий объём раствора для окрашивания, добавив 0,5 миллилитра к объёму, необходимому для покрытия клеток.
Перенесите рассчитанный объём из блокирующего буфера в новую трубку центрифуга, чтобы подготовить раствор для окрашивания. Затем добавьте соответствующий объём вторичного антитела в блокирующий буфер, чтобы получить правильную конечную концентрацию. Обмотайте пробирку центрифуга, содержащую вторичный раствор для окрашивания антител, алюминиевой фольгой и перемешайте раствор, продвигая вверх и вниз.
Добавьте достаточно вторичного раствора для окрашивания антител, чтобы покрыть поверхность. Поставьте тарелку на шейкер на 40 минут, чтобы прикрепить флуорофоры к отмеченным целям. Накройте чашу алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флюорофорами.
Через 40 минут выполните две промывки PBS, как было показано ранее. Если предпочитаете хранение, добавьте достаточно PBS в тарелку, чтобы покрыть поверхность клетки перед хранением. Оберните чашу парапленкой, чтобы предотвратить испарение жидкости, а затем алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеление флюорофоров.
Храните упакованную чашу при четырёх градусах Цельсия до готовности к визуализации. Последовательный протокол окрашивания позволил получить репрезентативные трёхцветные хроматиновые dSTORM-изображения для нескольких клеточных линий, включая BJ фибробласт, HeLa и MCF 10A. Конвейер анализа оценивался с использованием смоделированных наборов данных, представляющих нормальные однородные тороидальные и случайные пространственные распределения, прикреплённые к позициям кластеров гетерохроматина.
Различительные пространственные структурные паттерны создавали характерные профили гистограмм расстояний при анализе координат локализации относительно центроидов гетерохроматина. Смоделированные пространственно сегрегированные маркеры в нормальной хориоидальной конфигурации обеспечивали минимальную плотность суставов, что приводило к плоскому профилю распределения. Имитация перекрывающихся маркерных узоров в обычной случайной конфигурации приводила к уменьшению плотности соединения с увеличением расстояния от опорных точек.
Идентификация доменов гетерохроматина на основе DB-сканирования позволила классифицировать их на малые, средние и большие домены на основе эффективного радиуса. Количественный анализ расстояний показал, что РНК-полимераза II и H3K27ac локализуются вблизи границ гетерохроматина в малых, средних и больших областях. Анализ плотности суставов показал пиковую колокализацию H3K27ac и РНК-полимеразы II сразу за границами кластеров гетерохроматина.
Используя этот протокол, исследователи могут исследовать, казалось бы, неупорядочённую организацию хроматина, чтобы понять взаимосвязь между его структурой, регуляторными элементами и функциональными результатами. После этой процедуры различные вычислительные анализы на основе изображений или точечного облака могут извлекать количественные структурные особенности из пространственных данных, в зависимости от используемого метода изображения. Исследователи могут расширить этот метод маркировки, оптимизируя дополнительные маркеры и используя многоканальные данные для более продвинутого и комплексного анализа.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
