Флуоресцентный протокол предварительного скрининга ингибиторов синтеза белка из природных источников

Флуоресцентный протокол предварительного скрининга ингибиторов синтеза белка из природных источников. Синтез белка включает высокорегулируемые процессы, транскрипцию и трансляцию. Транскрипция в первую очередь регулируется транскрипционными факторами, модификациями хроматина и регуляторными РНК.

Трансляция регулируется факторами инициации, сигнальными путями и механизмами стабильности РНК. Эти регуляторные системы позволяют клеткам поддерживать функции клеток и эффективно реагировать на стресс или повреждения. Раковые клетки нарушают синтез белков, захватывая трансляционные механизмы для поддержки своих высоких энергетических потребностей и неконтролируемого роста.

Это перепрограммирование является результатом дисрегуляции почти всех основных онкогенных сигнальных путей, способствующих выживанию, пролиферации и метастазированию клеток, одновременно подавляя пути гибели клеток. Поскольку этот усиленный синтез белка имеет решающее значение для выживаемости при раке, методы лечения, направленные на этот процесс и блокирующие процессы, выглядят перспективно как потенциальные терапии. Для выявления ингибиторов синтеза белка можно использовать следующий флуоресцентный анализ подавления синтеза белков.

Перед началом эксперимента, чтобы получить надёжные результаты, соединения должны вводиться в соответствующей концентрации ниже порога токсичности. Для установления начальной концентрации необходимо провести анализ цитотоксичности для определения EC 50 соединения. Если это невозможно, соединения в этом анализе можно тестировать в зависимости от дозы для определения наиболее эффективных параметров концентрации.

Если концентрация соединения вызывает гибель клеток, становится необходимым тестирование при сниженных концентрациях. Также важно всегда защищать красители от света, когда они не используются. Длительное освещение приводит к фотоотбеливанию, что приводит к снижению качества данных.

Шаг 3.1: подготовьте мастер-смесь A, маркируйте центрифугную трубку как A, затем пипетьте 598,5 микролитров культурной среды и 1,5 микролитра белкового метка в A. Повторно суспензировать эту смесь для обеспечения единородности, пипетируя вверх и вниз. Теперь подготовьте мастер-смесь B. Маркируйте центрифугную трубку как B, затем пипетьте 1,5 микролитра белковой метки, 6,6 микролитра циклогексимида и 591,9 микролитра культурной среды в B. Повторно суспензируйте эту смесь для обеспечения однородности, проводя вверх и вниз. После пипетирования одного микролитра тестового состава и одного микролитра транспортного средства в две скважины, аккуратно пипетируйте 99 микролитров мастер-смеси А в обе эти скважины, пипетки под углом в боковую сторону скважины, чтобы предотвратить кинетическое нарушение клеток.

Пипет 100 микролитров мастер-смеси B в две необработанные скважины. Пипетки под углом в сторону колодца, чтобы предотвратить кинетическое нарушение клеток. Аккуратно постукуйте по пластине, чтобы полностью внедрить нужные компоненты в ячейки.

Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут — двух часов. Удалите клеточную культурную среду с помощью аспирации. Наклоните пластину и аспирируйте сбоку ямы вместо центра, чтобы предотвратить кинетическое возмущение клеток.

Затем добавьте 100 микролитров буфера PBS в каждую скважину и центрифугуйте пластину при температуре 900 г в течение пяти минут. После центрифугирования не забудьте удалить буфер PBS с помощью аспирации. Пятый шаг — фиксация и проницаемость.

Добавьте 100 микролитров фиксирующего раствора в каждую скважину. Затем инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 15 минут в тёмной среде. Затем аспирируйте клетки.

Промыйте клетки 100 микролитрами буфера для стирки и удалите с помощью аспирации. Повторите это дважды. Добавьте 100 микролитров буфера проницаемости в каждую скважину.

После этого инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Удалите буфер проницаемости с помощью аспирации. Шестой шаг — реакция белка и окрашивание.

Приготовьте смесь реакционного коктейля мастера. Добавьте 651 микролитр буфера PBS в центрифугную трубку. Затем добавьте семь микролитров медного реагента 100 раз.

Затем семь микролитров флуоресцентного азида. И, наконец, добавьте 35 микролитров восстанателя в пробирку центрифуга. Следуйте точно такому порядку при добавлении реагентов, затем добавляйте 100 микролитров реакционного коктейля в каждую яму.

Инкубировать клетки в течение 30 минут в тёмной среде при комнатной температуре, чтобы предотвратить фотоотбеливание. Центрифугуйте клетки при температуре 900 г в течение пяти минут. Аспирировать, промыть клетки и снова аспирировать.

Приготовьте 1-кратное разбавление общей окрашивания ДНК и добавьте 100 микролитров в каждую яму. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 минут в тёмной среде, чтобы предотвратить фотоотбеливание. Центрифугуйте пластину при 900 г в течение пяти минут.

Промыйте клетки 100 микролитрами буфера для мойки, удаляйте аспирацией. Повторите этот шаг дважды. Наконец, снова суспензируйте клетки с помощью 100 микролитров охлаждённого буфера PBS, чтобы подготовить их к визуализации.

Восьмой шаг — визуализация. Вставьте пластину в считыватель пластин и установите увеличение на 20 раз. Проанализируйте окрашивание ядра с помощью канала GFP 469/525 нанометров.

Используйте автобендинг и автофокус для улучшения результатов съёмок. Проанализировать активный синтез белка с помощью 586/647-нанометрового канала Texas Red. Используйте автобендинг и автофокус для улучшения результатов съёмок.

Флуоресцентные зонды чувствительны к фотоотбеливанию — явлению, при котором излучение со светом приводит к потере флуоресцентных свойств. Красители должны быть защищены от света в любое время, когда они не используются. Кроме того, количество сканирований в каждой скважине и время под облучённым светом необходимо ограничить.

Длительное воздействие света приведёт к фотоотбеливанию, что в конечном итоге приводит к снижению качества данных. Давайте посмотрим на репрезентативные результаты. Живые клетки здесь видны зелёным цветом, а активный синтез белка обозначается красным.

Известный ингибитор синтеза белка циклогексимид приводит к значительному снижению синтеза белка, как показано на рисунке 1B по сравнению с отрицательным контрольным DMSO на рисунке 1A, при этом испускается меньше красного флуоресцентного света. Обработка соединением один, как показано на рисунке 1C, приводило либо к отслоению клеток, либо к гибели клеток. Таким образом, мы не можем утверждать окончательные заявления о его ингибирующей активности синтеза белка.

Это требует дальнейших исследований с реакцией на дозу, чтобы попытаться определить, подавляет ли он синтез белка при низких концентрациях. Второе соединение демонстрирует умеренное подавление синтеза белка, как показано на рисунке 1D. Этот флюорометрический анализ является ценным исследовательским инструментом и доступным методом химической биологии для подготовки студентов бакалавриата.

Обеспечивая доступный и эффективный протокол с минимальной обработкой данных, она предоставляет студентам практический опыт и современные методы поиска лекарств, а также ускоряет процесс их открытия. Протокол использует флуоресцентный субстрат и передовые методы флуоресцентной микроскопии для систематического обнаружения и измерения ингибиторных возможностей природных продуктов первого и второго компонентов. Используя циклогексимид в качестве эталонного ингибитора, оба натуральных продукта демонстрировали разные уровни подавления синтеза белка.

По мере роста спроса на новые ингибиторы синтеза белка этот подход предоставляет студентам значимые исследовательские возможности и способствует развитию терапии рака.