Обновленный протокол сборки и использования минибиореакторной решетки (МБР)

Поэтому наши исследования сосредоточены на микробиоме кишечника, в частности, на том, как его можно спроектировать для предотвращения колонизации вредных патогенов. В то же время мы также заинтересованы в понимании экологических правил и механизмов, лежащих в основе этого сопротивления колонизации. Такие технологии, как секвенирование нового поколения, передовая биоинформатика, стерильные мыши и модели кишечника in vitro, трансформируют то, как мы изучаем микробные сообщества и их роль в здоровье и болезнях.

Одной из самых больших проблем с моделями кишечника in vitro является их работа с высокой пропускной способностью. Что нам нужно, так это системы, которые позволяют проводить функциональное исследование микробных сообществ в масштабе. Минибиореакторная установка представляет собой систему непрерывного культивирования, которая была разработана для решения проблемы нехватки пропускной способности в других системах.

Это позволяет нам масштабировать эксперименты, сохраняя при этом сложное и воспроизводимое поведение микробного сообщества. Для начала убедитесь, что полоски массива минибиореактора напечатаны на 3D-принтере и содержат шесть независимых камер биореактора. Расставьте все компоненты, необходимые для сборки.

С помощью метчика с фракцией 28 NF диаметром 1/4 дюйма с Т-образной рукояткой. Проденьте резьбу в три 1/4-дюймовых порта в каждой камере, чтобы вставить фитинги. После промывки камеры водой поместите в каждую камеру магнитную мешалку размером 10 на 3 миллиметра и добавьте один миллилитр дистиллированной воды.

Затем установите резиновую шайбу в верхней части каждого порта биореактора. Для каждой камеры вкрутите в порты одну приманку с соломинкой и трубкой, одну приманку с трубочкой и одну пустую приманку с резьбой. Теперь вставьте шесть резиновых перегородок на 3/32-дюймовые заусеницы для самок и загните верхнюю втулку каждой перегородки вниз, чтобы покрыть шею.

Прикрепите их к специальным портам каждой камеры. Отрежьте полоски трубки C-flex нужной длины и количества. Прикрепите заусенец для приманки с внутренней резьбой 1/8 дюйма к одному концу и соединитель для замка приманки с наружной резьбой к противоположному концу трубки каждого отрезка.

Затем вставьте заусеницу женской приманки диаметром 1/16 дюйма в каждый конец красной двухступенчатой трубки E-lab с внутренним диаметром 1,14 миллиметра и оранжевой двухступенчатой трубки E-lab с внутренним диаметром 0,89 миллиметра. Подсоедините подготовленную трубку E-lab к трубке C-flex и убедитесь, что каждая из шести длин трубок C-flex подключена к одной красной и одной оранжевой леске E-lab с помощью приманок-гнезд. Затем отрежьте трубку C-flex на разную длину по мере необходимости.

Прикрепите 1/8-дюймовый заусенец для внутренней приманки и соединитель замка приманки с наружной резьбой к обоим концам одного 3-дюймового куска и 12-дюймового куска трубки C-flex. Прикрепите разъемы фиксатора приманки с наружной резьбой к обоим концам оставшихся частей. Соберите дерево линии отходов в соответствии с 3D-схемой.

Прикрепите открытые концы красной трубки E-lab с двумя остановками к концевым замкам приманки с наружной резьбой на дереве водопровода в порядке возрастания длины трубки C-flex. Затем соедините 3-дюймовую трубку C-flex с 1/8-дюймовым разъемом для фиксации внутренней приманки и фиксатором приманки для наружной приманки к верхней части дерева сточной линии. Соберите дерево линий подачи в соответствии с 3D-схемой.

Соедините открытые концы оранжевой трубки E-lab с двумя остановками к концевым замкам приманки с наружной резьбой на дереве подающей линии в порядке возрастания длины трубки C-flex и прикрепите 12-дюймовую трубку C-flex к вершине дерева подающей линии. Прикрепите трубки C-flex переменной длины в конце дерева подающей линии к биореактору, расположив их в порядке возрастания от самой короткой линии слева до самой длинной справа. Прикрепите трубку C-flex переменной длины в конце дерева трубопровода отходов к полосе биореактора в порядке убывания: самая длинная линия слева и самая короткая справа, чтобы разместить насос.

Свяжите все линии подачи C-flex вместе с левой стороны полосы и закрепите их стяжкой. Сформируйте петлю с помощью оранжевой трубки E-lab с двумя ступенями между линиями C-flex и закрепите петлю с помощью автоклавной ленты, а затем повторите процесс для красной трубки E-lab с двумя остановками на стороне отходов полосы биореактора. Накройте приманку для самок в конце отходов и кормовой линии деревьев фольгой, чтобы предотвратить загрязнение.

Ослабьте приманки с мужской резьбой с перегородками на каждой камере биореактора, чтобы дать возможность пару выйти во время автоклавирования. После помещения сборки в бункер автоклава растяните деревья линий подачи и отходов в отдельные бункеры, примыкающие к бункеру, содержащему полосы MBRA. Чтобы прикрепить систему к насосам, снимите автоклавную ленту, фиксирующую трубку E-lab для отвода и подачи, и развяжите пучки трубок C-flex.

Расположите MBRA между двумя насосами в верхней части мешалки. Зажмите его с помощью напечатанных на 3D-принтере держателей и совместите с отмеченными местами перемешивания на пластине. Теперь прикрепите трубки линии подачи E-lab к картриджам перистальтического насоса и поместите упоры трубок в пазы картриджей.

Повторите процесс для трубки трубопровода E-lab на насосе, расположенном справа от мешалки. Затем зафиксируйте перистальтические картриджи насоса в насосе. Аккуратно расположите трубки C-flex с помощью напечатанных на 3D-принтере держателей пробирок.

Подсоедините конец дерева мусоропровода к трубке, подсоединенной к бутылкам для отходов. Затем прикрепите приманку с внутренней резьбой на входной трубке подающей магистрали к наружному разъему на 12-дюймовой трубке от крышки бутылки со средой. Включите оба насоса, чтобы запустить поток среды, и убедитесь, что оба насоса настроены на вращение по часовой стрелке, когда отходы расположены справа от насосов.

Наблюдайте за размером капель и частотой вращения педалей в каждой камере биореактора. Если замечены какие-либо изменения или отклонения от нормы, замените оранжевую двухступенчатую трубку E-lab, подключенную к соответствующей камере, чтобы уменьшить колебания расхода. Как только камеры будут заполнены, выключите оба насоса и дайте биореакторам постоять от 24 до 48 часов, чтобы проверить загрязнение перед началом эксперимента.

Переключите вход фильтрующего материала на литровую емкость с 10% отбеливателем в деионизированной воде и увеличьте расход на обоих насосах до максимума, чтобы вытеснить содержимое камер биореактора отбеливателем. Как только камеры очистятся от среды, переверните MBRA для дезинфекции выше линии заполнения в течение пяти минут. Через пять минут выровняйте систему и подождите еще пять минут для стерилизации.

После того как камеры будут очищены от среды и стерилизованы в течение 10 минут, замените отбеливатель одним литром деионизированной воды и промойте систему до тех пор, пока вода не пройдет через них. Затем отсоедините трубки биореактора E-lab от насосов и снимите MBRA. Удалите использованные перегородки из биореактора и слейте воду из каждой камеры, пока не останется только один миллилитр воды.

Замените перегородки, оранжевую трубку E-lab с двумя ступенями и автоклавируйте полностью собранную полосу, как было показано ранее. После трех циклов повторного использования выполните следующие действия. Образец человеческих фекалий был подготовлен и выращен в системе MBRA.

После четырех дней непрерывного потока в микробном сообществе во всех девяти биореакторах преобладали 18 родов бактерий, каждый из которых составлял не менее 2% относительной численности в любой реплике. 22 из 65 обнаруженных родов присутствовали во всех девяти репликах биореакторов, демонстрируя высокую воспроизводимость. Анализ альфа-разнообразия показал минимальные различия между репликами как в наблюдаемых операционных таксономических единицах, так и в индексе разнообразия Шеннона.