Модульный рабочий процесс для количественного, структурного и функционального анализа биопленок Leptospira

Мы изучаем биопленки как защитные структуры, обеспечивающие устойчивость в окружающей среде и хозяина, изучая динамику формирования, молекулярный состав, адаптивные особенности и вклад в инфекцию. Объединяя кристаллический биоанализ, временную текстовую визуализацию, конфокальную микроскопию, сканирующую электронную микроскопию и транскриптомику в наших лабораториях, способствует развитию исследований биопленок через интегрированный многомерный анализ. Для начала выращивайте клетки Leptospira в среде EMJH в стеклянных трубках с плоским дном.

Инкубировать культуры в аэробных условиях при 30 градусах Цельсия без встряхивания, пока они не достигнут средней логарифмической фазы. Убедитесь, что оптическая плотность культур достигает от 0,2 до 0,4 при 405 нанометрах, что соответствует двух-пяти умножить на 10 при мощности восьми элементов на миллилитр. Используя микроскоп с тёмным полем при увеличении 20 раз, убедитесь, что клетки модальны, а не сгруппированы.

Разведите подтверждённую среднелогарифмическую аритмическую фазовую культуру в соотношении один к 100 в свежей среде EMJH, чтобы получить примерно один раз на 10 с мощностью шести элементов на миллилитр, и аккуратно перемешайте инверсией без вихря. Теперь используйте стерильные щипцы, чтобы разместить одну 0,1-микрометровую стерильную гидрофильную поликарбонатную мембрану плоско на дне каждой скважины в стерильную пластину на 24 лунки с крышкой. Добавьте по миллилитру стерильной среды EMJH в каждую скважину и предварительно замочите мембрану на два часа при 30 градусах Цельсия.

Далее удалите раствор для замачивания из каждой колодцы, не смещая мембрану, и добавьте 1,5 миллилитра разбавленной бактериальной суспензии, чтобы мембрана оставалась на месте на дне. Затем поставьте поддон с водой внутри инкубатора для поддержания влажности. Инкубировать пластину при 30 градусах Цельсия при статических условиях для образования биопленки.

Оставляю пластину на три недели для медленнорастущих штаммов. В нужное время аккуратно вдыхайте как можно больше культурной среды, не нарушая биопленку. Аккуратно промыйте каждую скважину с помощью одного миллилитра стерильного PBS, при этом оставляя мембрану ровной у дна.

Добавьте по миллилитру 4% параформного альдегида в PBS в каждую скважину и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут для фиксации образцов биопленки. После инкубации снимите фиксатор и аккуратно дважды прополосните одним миллилитром PBS. Добавьте в каждую скважину по миллилитру раствора кристаллического фиолетового раствора 0,1% по весу по объёму и инкубуйте при комнатной температуре 15 минут, убедившись, что слой покрытия полностью погружен.

Затем сбросьте кристаллический фиолетовый краситель из каждой колодки и дважды прополосните одним миллилитром PBS. Наклоните пластину и спустите всю оставшуюся жидкость. Оставьте тарелку при комнатной температуре, чтобы она высохла на воздухе, пока субстрат не станет полностью сухим, желательно на ночь.

Далее добавьте в каждую скважину 500 микролитров элюцианского буфера, состоящего из 50% этанола и 50% уксусной кислоты по объёму. Вверх и вниз, чтобы полностью растворить пятно, привязанное к биопленке. Теперь перенесите по 200 микролитров каждого образца на оптически чистую микропластину с 96 лунками.

Измеряйте поглощение на уровне 570 нанометров и вычитайте фоновые значения из невакцинированных контролей, обработанных на всех этапах. Запишите среднее и стандартное отклонение как минимум для трёх технических повторений. Получите биопленки в скважинных пластинах, как показано ранее.

Добавьте раствор 4% параформного альдегида и 1% глутаральдегида в 0,2-молярном натриевом буфере при pH 7,4 в колодцы. Инкубировать фиксированные образцы в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите фиксатор и дважды промите образец PBS, чтобы сохранить прикреплённую поверхность биопленку и минимизировать отслоение.

Теперь погрузите крышку в 1% тетроксид осмия, разбавленный в PBS, и инкубируйте в течение часа для усиления контраста сканирующей электронной микроскопии. Затем дважды промывайте субстрат PBS. Обезвоживайте образцы, погружая их последовательно по 10 минут в серии градированного этанола.

Далее добавьте 500 микролитров гексаметилдисилазана и инкубируете в течение пяти минут. Затем замените свежим гексаметилдисилазаном и инкубируете ещё пять минут. После этого удалите лишний раствор и дайте образцу полностью высохнуть на воздухе под вытяжкой.

Теперь закрепите высушенные образцы на сканирующей электронной микроскопии с помощью двусторонней проводящей углеродной ленты. Покройте образцы тонким слоем — примерно 10 нанометров золота или платины для усиления контраста электронов при визуализации. В завершение загрузите подготовленные заглушки в сканирующий электронный микроскоп с помощью соответствующего держателя образца.

Если возможно, эвакуируйте камеру на ночь для улучшения качества изображения. Затем получите изображения вторичных электронов при напряжении от пяти до 15 киловольт с использованием соответствующих увеличений для визуализации ультраструктуры биопленки. После 21 дня инкубации кристаллическое фиолетовое окрашивание выявило видимые узоры биопленки как на поликарбонатных фильтрах, так и на стеклянных покрытиях для Leptospira interrogans и Leptospira biflexa.

Каждый вид демонстрирует характерные архитектурные отпечатки, такие как точечные, ветвящиеся или сетчатые формы. Измерения поглощения на 570 нанометров подтвердили лучшее удержание кристаллической фиолетовой клетки в биопленках Leptospira byflexa по сравнению с Leptospira interrogans во всех временных точках, что указывает на более высокое накопление биомассы в штаме. Сканирующая электронная микроскопия биопленок Leptospira interrogans зафиксировала ранние внеклеточные матриксовые отложения в трёхдневных биопленках — зрелую и каналированную базальную поверхность с трёхмерной структурой через 14 дней и полностью развитую матричную консолидацию с плотной архитектурой к 21 дню.

Наш оптимизированный протокол синхронизирует дополняющие показания из идентичных культур, повышая устойчивость, снижая вариабельность и раскрывая динамическую и структурную информацию, а также доступен с помощью подходов с использованием одного метода. Интегрируя комплементарный анализ, наши результаты стандартизировали оценку биопленок, проясняют динамику и архитектуру лептоспиры. Они связывают структуру с вирулентностью и укрепляют воспроизводимые сравнительные исследования.

Будущие мутанты связывают регуляцию с морфологией и динамикой биопленки, проясняют устойчивость окружающей среды и оценивают стратегии, нарушающие информацию о биопленке или способствующие распространению.