Визуализация и количественный анализ активации PARP1/PARP2, индуцированной генотоксином, в клетках с помощью репортера на основе флуоресцентного синтеза белка

Наша лаборатория изучает репарацию ДНК, зависящую от PARP1 и PARP2, а также пути ответа на повреждение ДНК в нормальных и трансформированных клетках. Одной из задач в этой области является количественный анализ активации PARP1 и PARP2 в клетках с предотвращением лизиса клеток. Это позволяет проводить исследования субклеточной локализации.

Для начала добавьте 375 микролитров сыворотки плода и DMEM без пенициллина-стрептомицина в стерильную микроцентрифугационную трубку объёмом 1,5 миллилитра. Затем добавьте 10 микролитров липидного трансфекционного реагента и все необходимые плазмиды в пробирку. Аккуратно постучите по микроцентрифугационной трубке, чтобы смешать среду, трансфекционный реагент и плазмидную ДНК.

Инкубировать при комнатной температуре в течение 15–30 минут для формирования комплекса реагентов ДНК и трансфекции. Далее добавляйте смесь плазмиды и реагента для трансфекции по капле в 60-миллиметровую чашу с культивированными клетками 293FT, не удаляя среду, и возвращайте клетки в инкубатор на 48 часов. Затем соберите культурную среду из трансфектированных клеток 293FT.

Для выделения частиц лентивируса фильтруйте собранную среду через стерильный фильтр диаметром 0,45 микрометра, чтобы отделить клеточный остаток от лентивирусных частиц. Для трансдукции берите нужные клетки, культивируемые в течение 24 часов, и проверяйте, что слияние клеток составляет от 20% до 40%. Далее добавьте один миллилитр вируса, один миллилитр ростовой среды и два микролитра полибрена в 15-миллилитровую коническую трубку, аккуратно смешав путём инверсии. Теперь удалите растительную среду из пластины с шестью колодцами.

Добавьте смесь вируса, среднего и полибрена в каждую колодцу. Поместите клетки с трансдукционной смесью в инкубатор с увлажнённой атмосферой при температуре 32 градуса Цельсия и 5% углекислого газа на 16–18 часов. Для проверки экспрессии аминокислот RNF146 — от 100 до 182 EGFP, семя — 200 000 клеток, экспрессирующих LivePAR, в одну культурную чашу с крышками.

Дайте клеткам от 24 до 36 часов, чтобы они прилипли к покрытиям, подготовьте среду и начните размножение. Затем экспрессирующие клетки LivePAR воздействуют заданные реагенты. Добавьте соединения непосредственно в среду, содержащую клетки на крышке, и аккуратно покрутите среду в контейнерах для клеточной культуры, чтобы распределить соединения.

Инкубировать 60-миллиметровые тарелки при 37 градусах Цельсия в течение 60–90 минут. Чтобы исправить клетки, удалите среду и промыйте их PBS. Префиксируйте клетки в 4% формальдегида в PBS на 15 минут при комнатной температуре.

После удаления формальдегида промыйте клетки трижды с помощью PBS. Затем добавьте три миллилитра холодного метанола и ацетона в соотношении 7:3, чтобы их исправить. Поставьте тарелку при минус 20 градусах Цельсия на девять минут.

Затем удалите раствор метанола-ацетона. После трёхкратной промывки клеток PBS нанесите 15 микролитров антифейдной среды с DAPI на стеклянный стекло. Аккуратно закрепите крышку на монтажной среде так, чтобы клетки были обращены внутрь, минимизируя пузырьки.

Центрируйте и закрепите крышку на стеклянном затворе и герметизируйте бока, нанеся небольшое количество прозрачной верхней эмали для ногтей по краям. Поставьте слайды в темноту, чтобы эмаль ногтя высохла. После скачивания и установки изображения J откройте Image J и установите текстовый файл макроса LivePAR_Macro, нажав на Плагины, выбрав Макросы и выбрав Установку.

Откройте все конфокальные файлы в Image J и сохраните их как TIFF-файлы, чтобы сохранить оригинальные файлы. Затем откройте документ в таблице и сохраните его как Date_CellLineFociAnalysis. Анализируйте по одному TIFF-файлу за раз.

Нажмите 1, чтобы найти ядра. Когда открывается окно менеджера ROI, выберите все записи и нажмите «добавить», чтобы наложить область ядер поверх исходного изображения. Удалять неправильно идентифицированные ядра и исключать ядра, которые не полностью находятся в рамке.

Затем нарисуйте ядро с помощью инструмента Freehand Selection и нажмите 2, чтобы количественно определить фокусы PAR. Выберите каждое ядро в менеджере ROI и подсчитайте количество фокусов на ядро. Скопируйте и вставьте количественные данные в открытый документ таблицы после того, как оцените все ядра в файле.

Аналогично, повторите анализ для всех TIFF-файлов. После завершения графика назначьте фокусы PAR на ядро в выбранном программном обеспечении. Контрольные клетки транспортных средств показали панклеточное окрашивание EGFP.

Клетки, обработанные генотоксином, показали накопление ядерных очаг, представляющих локализацию внутри ядра. Предварительное лечение ингибиторами PARP1 и PARP2 велипариба привело к потере очагов PAR. Количественная оценка количества очагов PAR на ядро в зависимости от времени и условий лечения показала схожие результаты.

Этот протокол позволяет количественно оценить активацию осей сигнализации PARP1 и PARP2 в ответ на генотоксины и последующие генетические изменения. Мы применили традиционные методы иммунофлуоресценции с этим анализом для подтверждения колокализации белков с полиАДФ-рибозой. В дальнейшем мы используем этот анализ для тестирования на генотоксичность для высокопроизводительного анализа ингибиторов PARP1, PARP2 или PARP, а также для выявления новых факторов, участвующих в сигнализации PARP1 и PARP2.