Essais d’organismes génétiquement modifiés

Environmental Science
 

Overview

Source : Laboratoires de Margaret Workman et Kimberly Frye - Depaul University

La modification génétique des aliments a été une question controversée en raison des inquiétudes débattus sur la santé et la sécurité environnementale. Cette expérience montre la compréhension technique de comment la nourriture ADN est génétiquement identifié, permettant éduqué décision prise sur les dangers de sécurité et possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans les denrées alimentaires.

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier l’ADN de la nourriture pour tester la présence d’ADN génétiquement modifié dans les produits alimentaires. Présence de bandes d’ADN spécifiques est détectée par électrophorèse sur gel de tirer des extraits alimentaires ADN par un gel d’agarose à 3 %, une concentration suffisamment dense pour séparer les bandes d’ADN contenant l’ADN génétiquement modifié. Plusieurs contrôles sont utilisés dans la procédure de l’électrophorèse pour s’assurer que l’ADN est extrait avec succès d’aliments test (amorce de la plante), et pour fournir des exemples connus des deux organismes génétiquement modifiées ADN (ADN génétiquement modifié a acheté) et non génétiquement modifiées ADN (acheté le contrôle des denrées alimentaires certifiés sans OGM).

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L'essentiel des sciences de l'environnement. Essais d’organismes génétiquement modifiés. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) identifie les séquences d’ADN qui ont été insérés dans la plante génétiquement modifiée. Contrairement aux protéines, l’ADN est une molécule relativement stable, donc des fragments d’ADN peuvent être isolés des produits hautement transformés et sont suffisamment intacts à être amplifié par PCR. Ingénieurs en génétique seulement un petit nombre de séquences régulatrices (séquences promoteur et terminateur) pour contrôler l’expression des gènes insérés, et si ces séquences sont communs à la plupart des cultures génétiquement modifiées. Les deux séquences identifiées dans cette procédure sont deux des principales séquences régulatrices, gène promoteur 35 s du virus de mosaïque du chou-fleur (CaMV) et gène terminator nopaline synthase (NOS) d’Agrobacterium tumefaciens.

PCR consiste à cycles répétitifs, chacune constituée de dénaturation modèle primer recuit et extension de l’amorce recuite par Taq ADN polymérase. Une fois que l’ADN est extrait de la nourriture, un thermocycleur est utilisé pour manipuler rapidement la température, entraînant les étapes des cycles de PCR.

L’étape de dénaturation intervient lorsque des échantillons sont chauffés rapidement à 94 ° C, causant séparer les brins d’ADN. Refroidissement rapide à 59 ° C permet d’amorces recuire pour les brins d’ADN séparés, puis réchauffer à 72 ° C pendant la Taq DNA polymérase d’étendre les amorces, effectuant une copie complète de chaque brin d’ADN et de compléter un cycle thermique.

L’amplification de l’ADN peut alors être effectué par un gel d’agarose avec électrophorèse pour séparer l’ADN en bandes visibles pour l’identification du gène promoteur 35 s et le terminateur de NOS. Amplification de l’ADN est chargé dans le puits à une extrémité du gel, en utilisant un colorant de chargement achetés qui contribue à alourdir l’échantillon afin d’empêcher la dissolution dans la mémoire tampon environnante. La teinture de chargement fournit également un visuel, donc le mouvement de l’ADN peut être vu pendant l’électrophorèse dans le colorant « front ». Le processus d’électrophorèse fonctionne en utilisant un courant électrique séparé en bouts de cathode et l’anode. L’ADN est chargé dans le gel sur l’extrémité la plus rapprochée du côté de la cathode de la chambre, et la charge négative de l’ADN est attirée vers la fin de l’anode de la chambre et est aspirée dans l’agarose. Plus grandes séquences de l’ADN (augmentation du nombre de paires de bases) ne peut pas passer aussi facilement d’agarose et seront séparera au début, alors que les petites séquences peuvent se déplacer plus loin vers le bas le gel vers la fin de l’anode.

Un processus de coloration aide en se liant à l’ADN afin d’ajouter du contraste entre le gel de l’arrière-plan et les banques d’ADN pour une meilleure visualisation des résultats. À l’aide fournie emplacements connus pour les différentes tailles de séquences d’ADN que chaque gel de test peut être analysé pour la présence ou l’absence du promoteur 35 s et gènes terminator amendements.

Les contrôles servent à assurer que correctement l’ADN est extrait et de fournir une comparaison avec les échantillons de nourriture. Apprêt plant acheté est ajouté à chaque échantillon d’acides nucléiques communs à toutes les plantes. Cela permet un contrôle de qualité sur le processus d’extraction de l’ADN, parce que tout ADN végétal extrait devrait être prolongée avec cette amorce pendant l’ACP et doit aussi être vu sur le gel après que électrophorèse est terminée. Apprêt acheté pour le 35 s et des gènes de NOS sont utilisés comme témoin positif pour fournir des bandes d’ADN sur le gel pour la modification génétique. Si le contrôle de modèle positif OGM ne pas amplifier, il y a un problème avec la réaction de PCR et un résultat négatif OGM de la nourriture de test n’est pas fiable. Un aliment non-OGM certifié est également acheté et utilisé comme contrôle négatif pour montrer ce que la séparation d’ADN ressemble lorsque aucun matériel génétiquement modifié n’est présent.

Procedure

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1. extraction de l’ADN d’échantillons de denrées alimentaires

  1. Ajouter 500 µL de matrice de mélange acheté PCR à chacun des 2 tubes à bouchon vissé à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une micropipette µL de réglage du volume 200-1 000. Pipetter en haut et en bas avec la pipette entre chaque aliquote de mélanger uniformément la matrice de la PCR.
  2. Tube avec bouchon à vis une étiquette « sans OGM » et l’autre « test ».
  3. Peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et mettez-la dans le mortier.
  4. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec un pilon pendant 2 min former une boue.
  5. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer avec un pilon jusqu'à ce que le coulis devient assez lisse à la pipette.
  6. Pipetter 50 µL de lisier au sol pour le tube avec bouchon à vis contenant 500 µL de prémélange PCR étiqueté « sans OGM » à l’aide de la marque 50 µL sur une pipette jaugée. Reboucher le tube.
  7. Répétez les étapes 1,3 et 1,6 pour préparer l’échantillon alimentaire.
  8. Pipetter 50 µL de sol test alimentaire boue pour le tube avec bouchon à vis marqué « test ». Reboucher le tube.
  9. Vortex du non-OGM alimentaires et test PCR tubes pour tubes de 1 min et place au bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. Si aucun vortex n’est disponible, mettez le tube plusieurs fois à mélanger avant de mettre dans le bain d’eau.
  10. Placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Une pastille solide devrait former au fond du tube. Si le pellet n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pendant 2 min d’intervalle jusqu’en formes de granulés.
  11. Tubes peuvent être utilisés immédiatement pour PCR ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

2. mise en place des réactions de PCR

  1. Numéro tubes PCR 1 – 6 et leur initiale. Les numéros doivent correspondre au contenu tube suivants énuméré au tableau 1.
  2. Placer chaque tube PCR identifié dans un microtube porte caps ouverts.
  3. Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 µL de l’apprêt indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR. Tubes de Cap.
  4. Avec une pointe fraîche pour chaque tube, ajouter 20 µL de l’échantillon d’ADN indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR, en veillant à ne Pipeter qu’à partir du surnageant et évitant le culot solid au fond des tubes.
  5. Après que chaque échantillon d’ADN est reversé dans le tube PCR correspondant, utilisez la pipette pour mélanger l’ADN et l’amorce de pipetage doucement de haut en bas ; Reboucher les tubes.
  6. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et programmer le cycler pour :
    Dénaturation initiale : 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min.
    Amplification : 40 cycles à 94 ° C pendant 1 min (dénaturer), 59 ° C pendant 1 min (recuit) et 72 ° C pendant 2 min (extension).
    Dernière Extension : 1 cycle à 72 ° C pendant 10 min.
    Tenez : 4 ° C indéfiniment.

3. préparation du Gel d’Agarose à 3 %

  1. À l’aide de laboratoire ou ruban adhésif, solidement ruban l’extrémité ouverte du bac gel. S’assurer que le ruban est scellé sur les bords du plateau pour empêcher la fuite d’agarose fondu.
  2. Peser avec 3 g d’agarose dans un erlenmeyer de 250 mL ou plu.
  3. Ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 (acheté ou préparé à partir de concentré).
  4. Utiliser une plaque magnétique avec une barre de remuer, chauffer le bol jusqu'à ce que le gel d’agarose est complètement dissous dans la mémoire tampon et la solution est en ébullition et se transforme en claire. Alternativement, un four à micro-ondes permet de placer le bécher au four et chauffage pour les intervalles de 30 s, en utilisant une tige d’agitation à mélanger toutes les 10 s, répéter jusqu'à ce que le mélange est en ébullition et tours clairs.
  5. Inverser une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL dans l’ouverture du flacon 250 mL d’agir comme un reflux, empêchant d’agarose solution de s’évaporer.
  6. Permettre d’agarose solution refroidir jusqu'à 60 ° C et verser de 30 à 50 mL dans chaque bac gel collées.
  7. Placer un peigne de gel dans la première paire des encoches pour créer les puits du gel.
  8. Laisser refroidir complètement avant d’enlever le ruban adhésif et un peigne. Gel va se solidifier et le tourner de clair à nuageux, quand prêt, environ 10-20 min.

4. électrophorèse des produits PCR

  1. Placer un gel d’agarose pré-faites de 3 % sur un plateau de gel ou utiliser un plateau de gel qui a été utilisé pour monter un gel d’agarose coulé de 3 %.
  2. Glisser le plateau de gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode (noir).
  3. Versez 1 tampon de x TAE dans la chambre, assez d’avoir 2 mm de tampon au-dessus de la barre d’État gel.
  4. Obtenir les tubes PCR du thermocycleur et dans porte-microtube.
  5. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 µL d’acheté Orange G colorant (LD) pour chaque échantillon de chargement et bien mélanger.
  6. Charge 20 µl de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel dans l’ordre indiquent (tableau 2).
  7. Électrophorèse en exécution pendant 30 min à 100 V.
  8. Retirer bac gel gel chambre et faites-le glisser pour retirer du plateau. Placer le gel dans un bac de coloration.
  9. Immerger le gel dans la tache de gel ADN acheté pendant 5 min, secouant délicatement plateau pour aider à distribuer la tache dans le gel.
  10. Transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec de l’eau du robinet (40-55 ° C) pendant environ 10 s.
  11. Décolorer en lavant x 3 dans l’eau chaude du robinet pendant 6 min chaque avec agitant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.
Nombre de tube Apprêt Échantillon d’ADN
1 Apprêt de plante 20 µL (vert) Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
2 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
3 Apprêt de plante 20 µL (vert) Alimentaire de 20 µL test ADN
4 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Alimentaire de 20 µL test ADN
5 Apprêt de plante 20 µL (vert) Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL
6 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL

Le tableau 1. Liste des numéros de tube approprié, amorces et des échantillons d’ADN.

Puits 1 1 contrôle des aliments Non-OGM végétaux amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 2 2 contrôle des aliments Non-OGM par OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 3 3 l’alimentation Test usine amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 4 4 aliments Test OGM amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 5 5 OGM ADN positif avec plante amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 6 6 OGM ADN positif avec OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Eh bien 7 Poids moléculaire de la PCR règle 20 µL.
Puits 8 Laissez vide.

Le tableau 2. L’ordre approprié pour charger 20 µL de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel.

Aliments génétiquement modifiés sont des produits qui contiennent un ingrédient ou des ingrédients dont l’ADN a été spécialement modifié. Présence de ces modifications peut être détectée en utilisant une technique appelée la réaction en chaîne par polymérase.

La modification génétique des aliments a été une question controversée en raison des inquiétudes débattus sur la santé et la sécurité environnementale. La capacité de détecter génétiquement modifiée ADN dans les échantillons alimentaires d’intérêt permet de prise de décision instruit sur les dangers de sécurité et possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés OGM, ou organismes, fournitures de bureau dans les aliments.

La polymérisation en chaîne, ou PCR, est utilisée pour amplifier les aliments ADN pour déterminer la présence ou l’absence de séquences génétiquement modifiées. Électrophorèse sur gel puis tire l’ADN amplifié par une matrice de gel d’agarose et sépare les bandes d’ADN de tailles différentes qui correspondent aux marqueurs modifiés ou non modifié. Ce sont ensuite comparés aux bandes de contrôle des aliments connus pour contenir des OGM, ou connus pour être libre de modification.

Cette vidéo illustre les principes qui sous-tendent la détection d’ADN génétiquement modifié provenant des aliments échantillons, comment extraire l’ADN et amplifier les marqueurs utilisés dans le processus de modification génétique et comment la présence ou l’absence d’OGM dans des échantillons d’aliments peut être mis en place.

Réaction en chaîne de polymérase identifie des séquences d’ADN qui ont été insérés dans les aliments génétiquement modifiés. L’ADN est une molécule relativement stable, donc viable convenable pour l’amplification des fragments d’ADN peuvent être isolés de même de multiples transformations marchandises, comme les croustilles de maïs ou les hamburgers de légumes.
Un petit nombre de séquences régulatrices de l’ADN est utilisé pour contrôler l’expression des gènes insérés, alors ces séquences sont présentes dans la majorité des cultures génétiquement modifiées. Cette procédure identifie deux d'entre les plus couramment utilisés, le gène promoteur 35 s et le gène de la nopaline synthase terminator. La séquence de 35 s est un ardent promoteur et lorsqu’il est attaché à un gène inséré sera lecteur constants, des niveaux élevés d’expression. Le terminateur de nopaline synthase est ajoutée pour arrêter la transcription du gène inséré au point de terminaison souhaité.

PCR implique répétitives de chauffage et de refroidissement cycles dans un thermocycleur, une machine qui contrôle étroitement la température des tubes de réaction PCR. Chauffer l’échantillon à 94 ° C provoque des brins d’ADN se dénaturer et séparer. Refroidissement rapide entre 45 et 65 °C permet des amorces de recuire pour les brins d’ADN séparés. Enfin, réchauffage à 72 °C permet à l’enzyme polymérase de Taq d’étendre les amorces et la duplication complète de la région cible.

Apprêt plant acheté est ajouté à chaque échantillon et amplifie dans les échantillons contenant l’ADN végétal. Modèles positifs OGM pour 35 s et amendements sont utilisés pour fournir un contrôle positif pour les OGM. Un certifié sans OGM est utilisé comme contrôle négatif. Si aucune de ces réactions de contrôle montrent des bandes inattendus, les résultats des échantillons d’essai ne peut pas faire confiance.

Amplification de l’ADN est géré par un gel d’agarose par électrophorèse. Produits PCR sont mélangés avec un colorant et chargés dans le puits. L’ADN est chargé négativement et lors du chargement dans le gel à la fin de la cathode de la chambre se déplacera vers la fin de l’anode, lorsque le courant est appliqué. Plus grands fragments d’ADN ne peut pas bouger aussi facilement à travers le gel matrice donc va rester plus proche de la cathode, tandis que les plus petites séquences se déplacent vers la fin de l’anode, ce qui entraîne la séparation de l’ADN de différente taille en bandes distinctes.

Après électrophorèse sur gel de coloration permet de visualiser les bandes d’ADN séparés.

Maintenant que nous sommes familiers avec les principes qui sous-tendent la détection des OGM et l’utilisation de la PCR et l’électrophorèse pour l’identification des OGM, nous allons jeter un regard sur comment ceci peut être effectué en laboratoire.

Une fois les produits alimentaires d’intérêt ont été identifiés, l’analyse peut commencer. Pour extraire l’ADN, prenez deux tubes de bouchage propre et dans chacun de ces transfert 500 μl de réactif d’isolement ADN acheté, en veillant à Pipeter le mélange vers le haut et en bas entre les parties aliquotes de mélanger uniformément le réactif. Étiqueter le tubes « non-OGM », et l’autre « Test ».

Ensuite, peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et placer dans un mortier propre. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec le pilon pendant 2 min former une boue. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer la boue jusqu'à ce qu’elle devienne assez lisse à pipeter.

Distribuer 50 μL de la boue connue non-OGM pour le « sans OGM » étiqueté bouchage tube contenant le réactif d’isolement de l’ADN. Maintenant ajouter 50 μL de la boue d’échantillon test alimentaire dans le tube de bouchage marqué « Test ». Vortex les deux tubes contenant les échantillons d’aliments et réactif de l’ADN pendant 1 min. Ensuite, placer les tubes dans un bain d’eau à 95 ° C pendant 5 min. Enfin, placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Après examen, une boulette de solide doit être formée au fond du tube. Si un projectile n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pour des intervalles de 2 min jusqu'à ce qu’une forme de granulés. Échantillons peuvent maintenant être utilisés immédiatement pour PCR, ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

Tout d’abord, tubes PCR de numéro six. Ces numéros correspondra au contenu tube répertorié dans le tableau. Placez chacun des tubes PCR marqués dans un microtube de porte avec bouchons ouverts.

Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 apprêt μL, indiqué dans le tableau à chaque tube PCR. Ensuite, ajouter 20 μL des échantillons ADN indiqué dans le tableau à chaque tube PCR. Pipetter en haut et en bas pour mélanger. Pour les échantillons de granulés, veillez à pipeter qu’à partir du surnageant et éviter le culot solid au fond des tubes. Enfin, placez les tubes PCR dans un thermocycleur et programmez-le pour faire défiler le chauffage et le refroidissement des étapes indiquées dans le tableau.

Placer un gel d’agarose de 3 % dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode. Ajouter tampon TAE dans la chambre pour couvrir 2 mm au-dessus du compartiment de gel. Recueillir les tubes PCR auprès du thermocycleur et placez-les dans un microtube titulaire. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 μL d’ADN acheté chargement de colorant dans chaque échantillon et bien mélanger.

Avec une pointe fraîche chaque fois, charger les puits du gel d’agarose avec 20 μL de poids moléculaire souverain dans un puits et 20 μL de chaque échantillon dans les puits suivants, comme indiqué dans ce tableau. Définir la chambre d’électrophorèse de fonctionner à 100 V pendant 30 min.

Lorsque le gel est terminé en cours d’exécution, soigneusement débrancher la chambre gel, retirez le bac et glissez le gel dans un bac de coloration. Immerger le gel en acheté 100 x tache de gel pendant 5 min en secouant le plateau doucement pour distribuer la tache. Une fois colorés, transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec l’eau du robinet pendant environ 10 s. Destain de laver trois fois dans l’eau chaude du robinet pendant 3 min chacun, chacune avec une agitation douce pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.

La présence ou l’absence d’une bande de 200 bp en piste 4 indique si le test alimentaire contenant des OGM. Les amorces de plante déterminent si ADN végétal a été extrait avec succès de l’échantillon. Le contrôle des aliments non-OGM est un indicateur de résultats faussement positifs, se produiraient. Si le contrôle des aliments non-OGM sort comme positif, cela signifie que la PCR a été contaminé à un moment donné. Le contrôle de modèle OGM-positif est un indicateur de faux négatifs. Si le contrôle de modèle positif OGM ne pas amplifier, il y a un problème avec la réaction de PCR et un résultat négatif OGM de la nourriture de test n’est pas fiable.

Gels peuvent être placés sur un papier blanc ou jaune pour fournir un fond contrastant pour mettre en évidence des bandes d’ADN, ou un contraste accru peut être réalisé à l’aide d’une boîte à lumière UV.

La possibilité de tester des produits alimentaires ou produits d’ingrédients génétiquement modifiés est pertinente pour un certain nombre d’applications scientifiques ou réglementaires.

Il y a des preuves que l’ADN transgénique de cultures génétiquement modifiées peut devenir introduits dans les génomes des populations sauvages de cultures. Par exemple, pollinisateurs peuvent faciliter ce transfert par la fertilisation des plantes de type sauvage avec du pollen provenant d’une source génétiquement modifiée. Il s’agit d’un sujet de préoccupation, comme les impacts de la propagation de ces gènes insérés sur les écosystèmes dans leur ensemble ne sont pas bien comprises. Test de PCR des populations sauvages peut fournir des données sur le potentiel de propagation, ou confinement réussie, d’inserts génétiques.

Absence de marquage ou étiquetage incorrect des ingrédients génétiquement modifiés peut être une préoccupation des consommateurs. C’est peut-être en raison de la préférence du consommateur de la consommation, ou introduction potentielle d’allergènes pendant le processus de GM, même si ce dernier est controversé. Dans certains pays, des ingrédients génétiquement modifiés doivent figurer sur les emballages alimentaires. Organismes de réglementation dans ces pays peuvent utiliser PCR des tests pour vérifier l’exactitude de l’étiquetage des aliments.

Où la modification génétique introduite à une récolte confère une résistance de pesticide, certaines études ont soulevé des préoccupations au sujet de la production de « Super mauvaises herbes ». Essentiellement, il peut s’agir de n’importe quelle usine pas initialement destiné à la modification qui obtient la résistance aux pesticides par le biais de mécanismes tels que l’introgression ou hybridation. Ces plantes peuvent ensuite être capable de se propager avec plus de succès et être plus difficile à contrôler que ceux sans l’insert. PCR stable pour la modification génétique peut aider à mettre en évidence et de suivre ces populations potentielles afin de déterminer si cet écart pourrait s’avérer problématique.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE d’essais pour les aliments OGM. Vous devez maintenant comprendre les principes qui sous-tendent l’identification des aliments génétiquement modifiés à l’aide de la PCR, comment extraire et d’amplifier l’ADN provenant des aliments et comment déterminer si votre échantillon d’aliment a été génétiquement modifiée. Merci de regarder !

Results

Après décoloration, gels peuvent être analysés en regardant les ruelles de nourriture de test (tableau 3) pour déterminer si les bandes d’ADN pour le promoteur 35 s et des gènes terminator amendements sont présents dans les endroits connus sur le gel. Placer le gel sur une boite à lumière UV peut aider à fournir un contraste accru (Figure 1). Alternativement, les gels peuvent être placés sur du papier blanc ou jaune pour fournir un fond de couleur contrastante pour mettre en évidence des bandes d’ADN (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Un gel destained liste séparée des bandes d’ADN. Gel d’agarose après électrophorèse sur gel d’agarose sur boite à lumière UV.

Figure 2
Figure 2. Schéma des emplacements connus pour le promoteur 35 s et terminator NOS ADN. La présence ou l’absence d’une bande de 200 bp en voie 5 indique si oui ou non le test alimentaire contenant des OGM.

Lane 1 : Aliments non-OGM avec des amorces de plante 455 bp
Lane 2 : Aliments non-OGM avec des amorces d’OGM Aucune bande
Lane 3 : Tester les aliments avec des amorces de plante 455 bp
Piste 4 : Tester les aliments avec des amorces d’OGM 200 bp ou aucune bande
Lane 5 : OGM-positive modèle avec des amorces de plante 455 bp
Lane 6 : OGM-positive modèle avec des amorces d’OGM 200 bp
Lane 7 : Dirigeant de poids moléculaire PCR 1 000, 700, 500, 200, 100 bp

Tableau 3. Tailles de bande d’échantillon de PCR (paires de bases (bp)).

Applications and Summary

Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier l’ADN, permettant une large gamme d’ADN tests en laboratoire. Une zone d’essai maintenant possible avec PCR consiste à identifier les OGM en testant pour la présence ou absence de l’ADN des séquences utilisées dans la modification génétique des cultures vivrières. En règle générale, une culture est génétiquement modifiée pour conférer un avantage contre les répulsifs naturels à rendements idéales, par exemple les parasites (Figure 3), maladies, conditions de sécheresse (Figure 4), etc.. Parce que l’avantage est obtenu en insérant le matériel génétique d’une espèce différente dans l’ADN de la plante de culture, les potentiels pour la santé humain et les risques environnementaux ont été identifiés avec l’utilisation des OGM. Une préoccupation environnementale est la capacité de l’ADN génétiquement modifié doivent être échangées involontairement par des processus de pollinisation, qui pourraient conduire à l’ADN génétiquement modifiés entrant dans que les génomes de cultures destinés à être vendus comme non-OGM.

Figure 3
La figure 3. Larves de doryphore, dévorant les feuilles de la pomme de terre.

Figure 4
La figure 4. Maïs détruit par la sécheresse.

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1. extraction de l’ADN d’échantillons de denrées alimentaires

  1. Ajouter 500 µL de matrice de mélange acheté PCR à chacun des 2 tubes à bouchon vissé à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une micropipette µL de réglage du volume 200-1 000. Pipetter en haut et en bas avec la pipette entre chaque aliquote de mélanger uniformément la matrice de la PCR.
  2. Tube avec bouchon à vis une étiquette « sans OGM » et l’autre « test ».
  3. Peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et mettez-la dans le mortier.
  4. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec un pilon pendant 2 min former une boue.
  5. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer avec un pilon jusqu'à ce que le coulis devient assez lisse à la pipette.
  6. Pipetter 50 µL de lisier au sol pour le tube avec bouchon à vis contenant 500 µL de prémélange PCR étiqueté « sans OGM » à l’aide de la marque 50 µL sur une pipette jaugée. Reboucher le tube.
  7. Répétez les étapes 1,3 et 1,6 pour préparer l’échantillon alimentaire.
  8. Pipetter 50 µL de sol test alimentaire boue pour le tube avec bouchon à vis marqué « test ». Reboucher le tube.
  9. Vortex du non-OGM alimentaires et test PCR tubes pour tubes de 1 min et place au bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. Si aucun vortex n’est disponible, mettez le tube plusieurs fois à mélanger avant de mettre dans le bain d’eau.
  10. Placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Une pastille solide devrait former au fond du tube. Si le pellet n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pendant 2 min d’intervalle jusqu’en formes de granulés.
  11. Tubes peuvent être utilisés immédiatement pour PCR ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

2. mise en place des réactions de PCR

  1. Numéro tubes PCR 1 – 6 et leur initiale. Les numéros doivent correspondre au contenu tube suivants énuméré au tableau 1.
  2. Placer chaque tube PCR identifié dans un microtube porte caps ouverts.
  3. Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 µL de l’apprêt indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR. Tubes de Cap.
  4. Avec une pointe fraîche pour chaque tube, ajouter 20 µL de l’échantillon d’ADN indiquée sur le tableau 1 dans chaque tube PCR, en veillant à ne Pipeter qu’à partir du surnageant et évitant le culot solid au fond des tubes.
  5. Après que chaque échantillon d’ADN est reversé dans le tube PCR correspondant, utilisez la pipette pour mélanger l’ADN et l’amorce de pipetage doucement de haut en bas ; Reboucher les tubes.
  6. Placer les tubes PCR dans le thermocycleur et programmer le cycler pour :
    Dénaturation initiale : 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min.
    Amplification : 40 cycles à 94 ° C pendant 1 min (dénaturer), 59 ° C pendant 1 min (recuit) et 72 ° C pendant 2 min (extension).
    Dernière Extension : 1 cycle à 72 ° C pendant 10 min.
    Tenez : 4 ° C indéfiniment.

3. préparation du Gel d’Agarose à 3 %

  1. À l’aide de laboratoire ou ruban adhésif, solidement ruban l’extrémité ouverte du bac gel. S’assurer que le ruban est scellé sur les bords du plateau pour empêcher la fuite d’agarose fondu.
  2. Peser avec 3 g d’agarose dans un erlenmeyer de 250 mL ou plu.
  3. Ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 (acheté ou préparé à partir de concentré).
  4. Utiliser une plaque magnétique avec une barre de remuer, chauffer le bol jusqu'à ce que le gel d’agarose est complètement dissous dans la mémoire tampon et la solution est en ébullition et se transforme en claire. Alternativement, un four à micro-ondes permet de placer le bécher au four et chauffage pour les intervalles de 30 s, en utilisant une tige d’agitation à mélanger toutes les 10 s, répéter jusqu'à ce que le mélange est en ébullition et tours clairs.
  5. Inverser une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL dans l’ouverture du flacon 250 mL d’agir comme un reflux, empêchant d’agarose solution de s’évaporer.
  6. Permettre d’agarose solution refroidir jusqu'à 60 ° C et verser de 30 à 50 mL dans chaque bac gel collées.
  7. Placer un peigne de gel dans la première paire des encoches pour créer les puits du gel.
  8. Laisser refroidir complètement avant d’enlever le ruban adhésif et un peigne. Gel va se solidifier et le tourner de clair à nuageux, quand prêt, environ 10-20 min.

4. électrophorèse des produits PCR

  1. Placer un gel d’agarose pré-faites de 3 % sur un plateau de gel ou utiliser un plateau de gel qui a été utilisé pour monter un gel d’agarose coulé de 3 %.
  2. Glisser le plateau de gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode (noir).
  3. Versez 1 tampon de x TAE dans la chambre, assez d’avoir 2 mm de tampon au-dessus de la barre d’État gel.
  4. Obtenir les tubes PCR du thermocycleur et dans porte-microtube.
  5. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 µL d’acheté Orange G colorant (LD) pour chaque échantillon de chargement et bien mélanger.
  6. Charge 20 µl de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel dans l’ordre indiquent (tableau 2).
  7. Électrophorèse en exécution pendant 30 min à 100 V.
  8. Retirer bac gel gel chambre et faites-le glisser pour retirer du plateau. Placer le gel dans un bac de coloration.
  9. Immerger le gel dans la tache de gel ADN acheté pendant 5 min, secouant délicatement plateau pour aider à distribuer la tache dans le gel.
  10. Transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec de l’eau du robinet (40-55 ° C) pendant environ 10 s.
  11. Décolorer en lavant x 3 dans l’eau chaude du robinet pendant 6 min chaque avec agitant doucement pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.
Nombre de tube Apprêt Échantillon d’ADN
1 Apprêt de plante 20 µL (vert) Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
2 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Contrôle des aliments Non-OGM 20 µL ADN
3 Apprêt de plante 20 µL (vert) Alimentaire de 20 µL test ADN
4 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Alimentaire de 20 µL test ADN
5 Apprêt de plante 20 µL (vert) Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL
6 Apprêt de 20 µL OGM (rouge) Contrôle positif ADN d’OGM 20 µL

Le tableau 1. Liste des numéros de tube approprié, amorces et des échantillons d’ADN.

Puits 1 1 contrôle des aliments Non-OGM végétaux amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 2 2 contrôle des aliments Non-OGM par OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 3 3 l’alimentation Test usine amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 4 4 aliments Test OGM amorces 20 µl de l’échantillon.
Puits 5 5 OGM ADN positif avec plante amorces 20 µL de l’échantillon.
Puits 6 6 OGM ADN positif avec OGM amorces 20 µL de l’échantillon.
Eh bien 7 Poids moléculaire de la PCR règle 20 µL.
Puits 8 Laissez vide.

Le tableau 2. L’ordre approprié pour charger 20 µL de la règle du poids moléculaire et 20 µL de chaque échantillon dans le gel.

Aliments génétiquement modifiés sont des produits qui contiennent un ingrédient ou des ingrédients dont l’ADN a été spécialement modifié. Présence de ces modifications peut être détectée en utilisant une technique appelée la réaction en chaîne par polymérase.

La modification génétique des aliments a été une question controversée en raison des inquiétudes débattus sur la santé et la sécurité environnementale. La capacité de détecter génétiquement modifiée ADN dans les échantillons alimentaires d’intérêt permet de prise de décision instruit sur les dangers de sécurité et possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés OGM, ou organismes, fournitures de bureau dans les aliments.

La polymérisation en chaîne, ou PCR, est utilisée pour amplifier les aliments ADN pour déterminer la présence ou l’absence de séquences génétiquement modifiées. Électrophorèse sur gel puis tire l’ADN amplifié par une matrice de gel d’agarose et sépare les bandes d’ADN de tailles différentes qui correspondent aux marqueurs modifiés ou non modifié. Ce sont ensuite comparés aux bandes de contrôle des aliments connus pour contenir des OGM, ou connus pour être libre de modification.

Cette vidéo illustre les principes qui sous-tendent la détection d’ADN génétiquement modifié provenant des aliments échantillons, comment extraire l’ADN et amplifier les marqueurs utilisés dans le processus de modification génétique et comment la présence ou l’absence d’OGM dans des échantillons d’aliments peut être mis en place.

Réaction en chaîne de polymérase identifie des séquences d’ADN qui ont été insérés dans les aliments génétiquement modifiés. L’ADN est une molécule relativement stable, donc viable convenable pour l’amplification des fragments d’ADN peuvent être isolés de même de multiples transformations marchandises, comme les croustilles de maïs ou les hamburgers de légumes.
Un petit nombre de séquences régulatrices de l’ADN est utilisé pour contrôler l’expression des gènes insérés, alors ces séquences sont présentes dans la majorité des cultures génétiquement modifiées. Cette procédure identifie deux d'entre les plus couramment utilisés, le gène promoteur 35 s et le gène de la nopaline synthase terminator. La séquence de 35 s est un ardent promoteur et lorsqu’il est attaché à un gène inséré sera lecteur constants, des niveaux élevés d’expression. Le terminateur de nopaline synthase est ajoutée pour arrêter la transcription du gène inséré au point de terminaison souhaité.

PCR implique répétitives de chauffage et de refroidissement cycles dans un thermocycleur, une machine qui contrôle étroitement la température des tubes de réaction PCR. Chauffer l’échantillon à 94 ° C provoque des brins d’ADN se dénaturer et séparer. Refroidissement rapide entre 45 et 65 °C permet des amorces de recuire pour les brins d’ADN séparés. Enfin, réchauffage à 72 °C permet à l’enzyme polymérase de Taq d’étendre les amorces et la duplication complète de la région cible.

Apprêt plant acheté est ajouté à chaque échantillon et amplifie dans les échantillons contenant l’ADN végétal. Modèles positifs OGM pour 35 s et amendements sont utilisés pour fournir un contrôle positif pour les OGM. Un certifié sans OGM est utilisé comme contrôle négatif. Si aucune de ces réactions de contrôle montrent des bandes inattendus, les résultats des échantillons d’essai ne peut pas faire confiance.

Amplification de l’ADN est géré par un gel d’agarose par électrophorèse. Produits PCR sont mélangés avec un colorant et chargés dans le puits. L’ADN est chargé négativement et lors du chargement dans le gel à la fin de la cathode de la chambre se déplacera vers la fin de l’anode, lorsque le courant est appliqué. Plus grands fragments d’ADN ne peut pas bouger aussi facilement à travers le gel matrice donc va rester plus proche de la cathode, tandis que les plus petites séquences se déplacent vers la fin de l’anode, ce qui entraîne la séparation de l’ADN de différente taille en bandes distinctes.

Après électrophorèse sur gel de coloration permet de visualiser les bandes d’ADN séparés.

Maintenant que nous sommes familiers avec les principes qui sous-tendent la détection des OGM et l’utilisation de la PCR et l’électrophorèse pour l’identification des OGM, nous allons jeter un regard sur comment ceci peut être effectué en laboratoire.

Une fois les produits alimentaires d’intérêt ont été identifiés, l’analyse peut commencer. Pour extraire l’ADN, prenez deux tubes de bouchage propre et dans chacun de ces transfert 500 μl de réactif d’isolement ADN acheté, en veillant à Pipeter le mélange vers le haut et en bas entre les parties aliquotes de mélanger uniformément le réactif. Étiqueter le tubes « non-OGM », et l’autre « Test ».

Ensuite, peser avec 0,5 g d’aliments certifiés sans OGM et placer dans un mortier propre. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée et broyer avec le pilon pendant 2 min former une boue. Ajouter un autre 2,5 mL d’eau distillée et continuer à broyer la boue jusqu'à ce qu’elle devienne assez lisse à pipeter.

Distribuer 50 μL de la boue connue non-OGM pour le « sans OGM » étiqueté bouchage tube contenant le réactif d’isolement de l’ADN. Maintenant ajouter 50 μL de la boue d’échantillon test alimentaire dans le tube de bouchage marqué « Test ». Vortex les deux tubes contenant les échantillons d’aliments et réactif de l’ADN pendant 1 min. Ensuite, placer les tubes dans un bain d’eau à 95 ° C pendant 5 min. Enfin, placer les tubes dans une centrifugeuse pendant 5 min. Après examen, une boulette de solide doit être formée au fond du tube. Si un projectile n’est pas formé après 5 min, centrifuger à nouveau pour des intervalles de 2 min jusqu'à ce qu’une forme de granulés. Échantillons peuvent maintenant être utilisés immédiatement pour PCR, ou conservés au réfrigérateur pendant 1 semaine.

Tout d’abord, tubes PCR de numéro six. Ces numéros correspondra au contenu tube répertorié dans le tableau. Placez chacun des tubes PCR marqués dans un microtube de porte avec bouchons ouverts.

Avec une pointe fraîche pour chaque ajout, ajouter 20 apprêt μL, indiqué dans le tableau à chaque tube PCR. Ensuite, ajouter 20 μL des échantillons ADN indiqué dans le tableau à chaque tube PCR. Pipetter en haut et en bas pour mélanger. Pour les échantillons de granulés, veillez à pipeter qu’à partir du surnageant et éviter le culot solid au fond des tubes. Enfin, placez les tubes PCR dans un thermocycleur et programmez-le pour faire défiler le chauffage et le refroidissement des étapes indiquées dans le tableau.

Placer un gel d’agarose de 3 % dans la chambre d’électrophorèse avec les puits le plus proche de l’extrémité de la cathode. Ajouter tampon TAE dans la chambre pour couvrir 2 mm au-dessus du compartiment de gel. Recueillir les tubes PCR auprès du thermocycleur et placez-les dans un microtube titulaire. En utilisant un embout de la pipette frais chaque fois, ajouter 10 μL d’ADN acheté chargement de colorant dans chaque échantillon et bien mélanger.

Avec une pointe fraîche chaque fois, charger les puits du gel d’agarose avec 20 μL de poids moléculaire souverain dans un puits et 20 μL de chaque échantillon dans les puits suivants, comme indiqué dans ce tableau. Définir la chambre d’électrophorèse de fonctionner à 100 V pendant 30 min.

Lorsque le gel est terminé en cours d’exécution, soigneusement débrancher la chambre gel, retirez le bac et glissez le gel dans un bac de coloration. Immerger le gel en acheté 100 x tache de gel pendant 5 min en secouant le plateau doucement pour distribuer la tache. Une fois colorés, transférer le gel dans un récipient de laver et rincer avec l’eau du robinet pendant environ 10 s. Destain de laver trois fois dans l’eau chaude du robinet pendant 3 min chacun, chacune avec une agitation douce pour de meilleurs résultats. Si nécessaire, continuer de décoloration à l’eau tiède jusqu'à ce que le contraste souhaité est atteint.

La présence ou l’absence d’une bande de 200 bp en piste 4 indique si le test alimentaire contenant des OGM. Les amorces de plante déterminent si ADN végétal a été extrait avec succès de l’échantillon. Le contrôle des aliments non-OGM est un indicateur de résultats faussement positifs, se produiraient. Si le contrôle des aliments non-OGM sort comme positif, cela signifie que la PCR a été contaminé à un moment donné. Le contrôle de modèle OGM-positif est un indicateur de faux négatifs. Si le contrôle de modèle positif OGM ne pas amplifier, il y a un problème avec la réaction de PCR et un résultat négatif OGM de la nourriture de test n’est pas fiable.

Gels peuvent être placés sur un papier blanc ou jaune pour fournir un fond contrastant pour mettre en évidence des bandes d’ADN, ou un contraste accru peut être réalisé à l’aide d’une boîte à lumière UV.

La possibilité de tester des produits alimentaires ou produits d’ingrédients génétiquement modifiés est pertinente pour un certain nombre d’applications scientifiques ou réglementaires.

Il y a des preuves que l’ADN transgénique de cultures génétiquement modifiées peut devenir introduits dans les génomes des populations sauvages de cultures. Par exemple, pollinisateurs peuvent faciliter ce transfert par la fertilisation des plantes de type sauvage avec du pollen provenant d’une source génétiquement modifiée. Il s’agit d’un sujet de préoccupation, comme les impacts de la propagation de ces gènes insérés sur les écosystèmes dans leur ensemble ne sont pas bien comprises. Test de PCR des populations sauvages peut fournir des données sur le potentiel de propagation, ou confinement réussie, d’inserts génétiques.

Absence de marquage ou étiquetage incorrect des ingrédients génétiquement modifiés peut être une préoccupation des consommateurs. C’est peut-être en raison de la préférence du consommateur de la consommation, ou introduction potentielle d’allergènes pendant le processus de GM, même si ce dernier est controversé. Dans certains pays, des ingrédients génétiquement modifiés doivent figurer sur les emballages alimentaires. Organismes de réglementation dans ces pays peuvent utiliser PCR des tests pour vérifier l’exactitude de l’étiquetage des aliments.

Où la modification génétique introduite à une récolte confère une résistance de pesticide, certaines études ont soulevé des préoccupations au sujet de la production de « Super mauvaises herbes ». Essentiellement, il peut s’agir de n’importe quelle usine pas initialement destiné à la modification qui obtient la résistance aux pesticides par le biais de mécanismes tels que l’introgression ou hybridation. Ces plantes peuvent ensuite être capable de se propager avec plus de succès et être plus difficile à contrôler que ceux sans l’insert. PCR stable pour la modification génétique peut aider à mettre en évidence et de suivre ces populations potentielles afin de déterminer si cet écart pourrait s’avérer problématique.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE d’essais pour les aliments OGM. Vous devez maintenant comprendre les principes qui sous-tendent l’identification des aliments génétiquement modifiés à l’aide de la PCR, comment extraire et d’amplifier l’ADN provenant des aliments et comment déterminer si votre échantillon d’aliment a été génétiquement modifiée. Merci de regarder !

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