血液撤退 I

Lab Animal Research

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Overview

来源: 凯斯图尔特, RVT, RLATG, CMAR;瓦莱丽. 施罗德, RVT, RLATG。圣母大学, 在

血液收集是一个共同的要求, 研究研究, 涉及老鼠和老鼠。小鼠和大鼠的血液提取方法取决于所需的血液体积、取样的频率、被放血的动物的健康状况以及技术员的技术水平。 1 所讨论的所有方法--向后眶窦出血、初始尾剪出血和心内出血--需要使用全身麻醉。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 实验动物研究精要. 血液撤退 I. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

在出血过程之前, 必须确定所需的样本类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清。对于全血, 必须在样品中加入抗凝剂。血浆, 其中含有纤维蛋白原和其他凝血因子, 当与红细胞分离, 可以从一个抗凝样本提取。血清是通过血液采集而获得的, 没有抗凝血。一旦血块形成, 血清就会从样品的离心中产生。由于样品已凝结, 血清不会含有纤维蛋白原或其他凝血因子。血浆和血清都是通过使用离心机运行在 2200-2500 RPM 至少15分钟.

对于必须产生全血或血浆的样品, 必须使用适当的抗凝剂。实验室动物常用的抗凝剂是肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸 (EDTA);选择的依据是研究的需要。封存--EDTA、肝素和枸橼酸钠的液体形式--可以直接装入注射器以涂上表面。这就可以直接接触抗凝血的血液被绘制, 协助预防凝血。由于鼠血凝块比大多数哺乳动物的血液凝结得快, 因此必须将抗凝血的正确比例用于血液采集.

针的选择基于动物的大小和静脉穿刺部位。一般而言, 针头的孔径越大, 样品收集起来就越迅速。对更大的针头来说, 减少对血液细胞的伤害是另一个好处。然而, 大口径针头的主要缺点是对容器的潜在损害。对小鼠和大鼠, 大小的选择范围从20-29 口径针, 是 0.5-1.5 英寸的长度。如果针头太长, 不仅使用起来很笨拙, 而且在针头上有多余的空间会导致凝固。"过程" 部分中的每个方法都列出了适当的针大小.

所需样本的大小也必须预先确定。由于小老鼠或老鼠的大小, 血液收集的最大数量必须计算为生存出血。每只体重25克的小鼠总血容量为1.8 毫升;平均体重250克的鼠总血容量为16毫升。对于没有液体置换的小鼠或大鼠的单个血液样本, 可以安全去除的最大血容量是总血容量的 10%, 或 7.7-8 和 #181; 因此, 对于一个普通的老鼠, 10% 的血容量是193-200 和 #181;对于250克的平均鼠来说, 这相当于 1.9-2.0 毫升. 研究表明, 去除超过15% 的血容量会引起休克休克。 12 然而, 随着体液置换, 多达15% 的总血容量-或12和 #181; 可以删除。对于25克鼠标, 这相当于300和 #181;对于一个250克大鼠, 它相当于3毫升。对于流体置换, 液体应加热, 并给予皮下注射.

如果需要取多个样本, 则会减少绘制的血量。每周可抽取的最大血量不超过总血容量的 7.5%, 即6和 #181; 对于一个25克鼠标, 这相当于145-150 和 #181; l 每星期。对于一个250克大鼠, 这相当于 1.45-1. 50 毫升每星期。 如果取样将每2周发生一次, 则可抽取10% 的总血容量 (8 和 #181; 升/克)。这相当于200和 #181; 每2周就有一只老鼠, 每2周就有2.00 毫升的250克老鼠。一项对平均重量为250克的大鼠进行的一项研究显示, 当血液的15-20% 被移除时, 血液水平的正常化需要超过29天的时间。 12 对于重复的血液收集, 液体替换不允许更大的血液容量或更频繁的血液汇集, 因为它只替换容量。这只动物需要时间补充血液细胞.

使用回溯式轨道丛是过去常见的做法。然而, 对这一程序的仁爱的许多关注已经出现。在手术过程中, 红细胞压积管的过度运动一旦放置在眼睛的内侧眼角, 就会对周围组织造成损伤, 导致眼睑和/或结膜膜肿胀。肿胀的组织可导致眼球凸出足够远, 使眼睑闭合受阻, 可能导致角膜干燥和损伤。肿胀的疼痛会引起抓挠和自残, 导致眼球摘除。不正确放置红细胞压积管在一个复古眶出血可以切断视神经, 导致失明。如果红细胞压积管是在一个不适当的角度推进, 眼睛可以被迫离开轨道, 让眼睑落在眼球后面。如果出现这种情况, 则很难将眼睛正确地替换到插槽中。其他可能出现的问题包括: 对脆弱的轨道骨骼的破裂, 眼球球体的穿透, 导致玻璃体液的丧失, 或者眼睛后面的血肿形成, 由于眼睛和周围的压力, 会导致极度疼痛。结构.尽管所有这些问题, 如果一个熟练的技术员执行的程序和动物完全麻醉与一般麻醉, 如异氟醚吸入麻醉, 复古眼眶出血已证明是一种有效的方法的血液收集啮齿目动物.

眶区的解剖结构在小鼠和老鼠之间是不同的。老鼠有一个复古的眼窝窦-一个收集的血管, 创造了一个鼻窦在轨道区域。在鼠眼的眼眶里, 有一丛血管在那眼后面流动;然而, 它们并不像老鼠那样形成一个窦。因此, 对小鼠进行这一过程比较容易。对于重复采样收集通过回溯轨道丛, 至少10天之间的出血是需要的, 使该地区的组织愈合。虽然一般麻醉建议, 该程序可以执行的小鼠没有全身麻醉, 如果一个局部眼科麻醉, 如丙或丁卡因, 是在程序之前应用。由于老鼠没有复古的眼窝窦, 而且由于它们的周围的细胞膜更强, 因此必须对它们进行麻醉.

小卷的串行样本可以通过使用尾夹方法获得。尾巴的最初截肢必须限制在尾巴尖端, 大约 0.5-1.0 毫米长的小鼠和2.0 毫米的大鼠。 1 通过将原始切口的痂或血块阻断到尾部的尾部, 可以进行血液采集的尾剪程序。一般情况下, 附加的尾端截肢是不必要的。收集的血量范围从20-100 和 #181; l 为老鼠和75-150 和 #181; 我r 老鼠。收集到的数量在动物之间是可变的, 并且可以受年龄、健康状况和体重的影响.

从尾部切片收集的样本可以同时包含动脉和静脉血, 以及组织产品的污染。如果尾巴被抚摸或 "挤奶" 以获得更多的血液, 样品质量就会降低。为了增加血液流量, 可以用热敷、加热灯或在温水中浸泡尾部来加热。应将压力应用于尾部止血, 每5-10 分钟检查一次动物, 以确保止血效果。止血常因反复取样而延迟。止血粉可用于止血。对于最初的截肢, 建议麻醉 (一般或局部)。随后的出血不应要求麻醉, 特别是当动物习惯于程序。麻醉将导致血压下降, 使血液收集与此技术困难.

尾剪的另一种选择是尾船尼克。这一过程很容易在老鼠和小鼠身上进行。然而, 与尾巴剪, 样品可能被污染与组织产品, 特别是在老鼠。对于大鼠, 皮下注射针头插入血管, 血液从针的中心收集。一项研究显示, 在穿刺部位上方放置止血带, 以帮助血液收集。 3 注射器不用于抽取血管中的血液, 因为注射器产生的压力会使血管坍塌。这种方法也可以用于连续取样, 因为血块可以被移除, 从而导致站点再次出血。与尾部剪, 这是当务之急, 以确保止血的应用压力, 对现场和复核的动物每5-10 分钟。

通常, 研究需要 nonsurvival, 通过失血通过心腔出血或骶管静脉收集的大血液样本. 4 总血容量的大约一半可以通过心脏穿刺从老鼠或老鼠收集。这相当于40和 #181; 或大约1毫升, 平均25克鼠标。250克老鼠会产生大约10毫升的血液。动物 必须 被麻醉为失血。吸入麻醉或 CO 2 麻醉可由熟练技师使用;注射麻醉也可以使用。然而, 血压和血液循环可能减少, 这可能会减少血液的采集量.

尾腔静脉法要求对动物进行深度麻醉以手术暴露血管。CO 2 麻醉是不够的, 因为心脏必须跳动和动物呼吸在血液撤退。在手术过程中, 抽血速度过快会导致血管塌陷, 咬合, 防止血液收集。此外, 船只的墙壁是薄的, 因此, 必须避免手和针的运动, 以防止从针进入现场的血液破裂或泄漏。由于针不是通过皮肤, 这种方法导致收集一个无菌样品。必须采用辅助安乐死的方法, 以确保动物不会从麻醉中恢复。这种方法通常是心脏或主动脉灌注后。

心腔方法可以在被麻醉 (闭合方法) 时用手动约束的动物进行, 或者心脏可以根据骶管静脉采血方法的协议被手术暴露 (open 方法)。对于封闭的方法, 针放置的标志是在剑过程中的肋骨笼形成的凹槽, 在动物的左侧。

Procedure

1. 复古眶出血

  1. 设备
    1. 准备一个钟形罐, 或麻醉诱导室, 以管理麻醉气体, 如异氟醚。使用铃罐时, 液体麻醉剂必须与动物接触, 避免通过皮肤吸收。可以使用具有小孔的平台.
    2. 50-75 升的 Microhematocrit 管是首选。聚脂薄膜缠绕的管子不太可能在操作者的手指之间折断, 应被视为安全措施.
    3. 在工作表面上放置一些纸巾厚度或其他绝缘材料, 以维护动物和 #39; 在过程中的身体热.
  2. 动物的准备和定位
    1. 该动物用吸入麻醉剂 (如异氟醚) 在钟罐或气体麻醉感应室中麻醉, 以使其生效.
    2. 一旦该动物被完全麻醉, 它将被移除并放置在侧卧床.
    3. 眼睛通过将手指放在头部顶部和下颌上, 并将皮肤向后和向下拉.
    4. 避免对气管施加压力, 因为这可能会使气道塌陷或咬合窒息导致死亡.
  3. 血液提取
    1. microhematocrit 被放置在眼睛的内侧眼角, 并定向尾在30-45 和 #176; 从鼻子的平面角度.
    2. 在轻轻旋转红细胞压积管时施加压力。这将切割通过结膜膜和破裂的眼丛.
    3. 血液会通过毛细管作用流入红细胞压积管.
    4. 避免推挤得如此之深, 以至于你击中了眼腔后面的骨头.
    5. 一旦血液开始流动, 保持眼睛凸出的压力.
    6. 收集多管血, 没有必要把下一管进入眼丛, 因为血液将继续流动, 可以收集, 因为它来自内侧眼角.
    7. 停止出血, 释放皮肤, 让眼睛回到正常位置。将压力施加到轨道上以确保止血.

Figure 1
图1。小鼠眼眶内退血.

2. 尾部出血程序: 尾剪和尾尼克

  1. 设备
    1. 无菌手术刀刀片, 优选为11刀片或单面刀片, 用于对尾部切片方法进行初始截断。剪刀不应使用, 因为剪刀的切割是粉碎, 从而促进凝结和减少血液流动。为尾巴尼克做法, 一个数字11或15手术刀刀片被用来做切割.
    2. 允许对鼠标尾部进行访问的约束管.
    3. 吸水纸巾或纱布用作执行尾部切片的基板.
    4. 收集管或红细胞压积管也需要.
    5. 止血粉应可用于止血.
  2. 约束
    1. 将动物放在管子里, 这样尾巴就可以进入。对于布鲁姆型位, 动物先将臀部拉入试管。对于其他管子, 动物先放头.
    2. 动物被固定在管子里, 这样它们就不能掉头或撤回尾巴.
    3. 一些老鼠会允许尾巴剪和血液收集, 如果允许它们抓取粗糙的表面, 那么它们将会受到最小的人工约束.
    4. 有些老鼠需要吸入麻醉才能收集这种血液.
  3. 血液提取
    1. 尾部用温水擦除碎片, 造成轻微的血管舒张。不要使用热水.
    2. 为尾巴剪, 尾巴是延长的, 并且尾巴的非常末端 (0.5-1 毫米为老鼠和至多2毫米为老鼠) 用手术刀刀片切开.
    3. 为尾巴尼克, 尾巴是延长的, 并且切口是用手术刀刀片大约2/3 距离从臀部, 直接地在侧向尾巴静脉.
    4. 尾巴可以从臀部到鼻尖, 以鼓励血液流动; 但是, 这将降低样本的质量.
    5. 血液是从顶端或尼克收集的, 使用红细胞压积管或允许滴入收集瓶中.

3。心脏采血

  1. 设备
    1. 鼠标, 一个3毫升注射器与22-25 口径 x 1 和 #34; 针是首选。较小的注射器没有相同的背压, 可以使血液退出更困难。小于25的针头限制了血液的流动, 导致血细胞的凝结和损伤增加。短于1和 #34 的针; 当从隔膜接近时, 可能达不到心脏的水平.
    2. 对于大鼠, 10-12 毫升注射器与18口径 x 1.5 和 #34; 针是首选。根据大鼠的大小, 一个较小的注射器可能无法容纳整个血容量被收集, 因此注射器将不得不改变过程中。小于20口径的针头限制血液的流动, 导致血栓的增加。短于1.5 和 #34 的针; 当从隔膜接近时, 可能达不到心脏的水平.
    3. 一个足够大小的采血管用于保存收集的血液.
  2. 约束
    1. 适当的约束对此方法的成功至关重要。动物是由颈背持有, 身体垂直悬挂。重要的是, 身体要直接防止心脏的偏转或胸部扭曲.
    2. 另一种体位是背部卧床, 当把针放在动物的肋骨和 #39 的左侧。这是特别有用的大鼠或当多个动物将流血.

Figure 2
图2。用垂直保持的小鼠取出心脏血.

  1. 血液提取
    1. 从后部的方法, 穿刺膈更容易完成时, 鼠标或老鼠是垂直举行的颈背。
      1. 针在动物和 #39 左侧的凹槽中是先进的, 剑.
      2. 针应与脊柱平行, 并置于肋骨下方.
      3. 心脏近似地位于手肘的水平.
      4. 将针放在胸前, 刺穿心脏.
      5. 在注射器上施加轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器.
      6. 等到血液填满注射器后再在锡尔河上添加额外的背压英英.
    2. 来自动物和 #39 的侧向方法需要将动物定位在背卧床。
      1. 入口点是根据胸壁上肘部的点来测量的。心脏近似地位于手肘的水平.
      2. 针插入垂直于表的平面, 位于胸壁的中点, 如测量的 dorsoventrally.
      3. 将针放在胸前, 刺穿心脏.
      4. 在注射器上施加轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器.
      5. 等待直到血液填满注射器, 然后再在注射器上添加额外的背压.

Figure 3
图3。用小鼠在背卧床位置取出心脏血.

  1. 技术提示
    1. 正常的心脏位于与顶端指向左边。在罕见的情况下, 心脏可能被逆转, 导致困难刺穿心脏.
    2. 过度背压对注射器可能崩溃心脏, 咬合针斜面并且停止血液流动入注射器.
    3. 应用背压并反复释放它将在注射器中引发凝固.
    4. 轻轻按压肝脏可以迫使血液进入循环系统, 使其可供提取.

4。后腔静脉血流提取

  1. 设备
    1. 使用25-29 针的 TB 注射器用于在鼠标中收集血液。对于大鼠, 10-12 毫升注射器与22-25 口径 x 1 和 #34; 针是必需的.
    2. 手术平台, 解剖托盘, 或其他表面, 以确保动物是需要的, 连同领带, 磁带, 或引脚, 以固定四肢的位置.
    3. 注射麻醉或吸入麻醉是必要的。如果使用吸入麻醉, 这是可取的麻醉是通过一个精密的汽化器与鼻锥。程序长度是这样的, 使用感应室没有额外的麻醉气体交付将不会提供足够的时间来完成的血液撤退之前, 动物苏醒.
    4. 鼠标的虹膜剪刀, 或手术室尖锐钝剪刀的老鼠, 是需要的, 连同小创伤拇指钳, 和2和 #34; x 2 和 #34; 纱布海绵.
  2. 约束
    1. 当动物完全麻醉时, 由脚趾捏或尾捏决定, 动物被置于背卧床。
    2. 四肢通过磁带或针脚固定在平台上。四肢应该远离身体.
  3. 撤回
    1. 皮肤被解除, 一个小的横向切口是通过皮肤略高于骨盆的女性, 或略高于男性包皮。
    2. 将剪刀的点放在切口中, 中线切开是通过从骨盆/包皮到剑的皮肤进行的.
    3. 皮肤侧向两侧反射。钝性剥离可能是必要的, 以放松它的基础肌肉.
    4. 肌肉被解除, 一个小的横向削减是通过肌肉刚刚在皮肤切割.
    5. 将剪刀的点放在腹部, 中线切口通过肌肉剑。一定要角剪刀和 #39; 向上点, 以避免切割任何器官.
    6. 沿两侧肋骨的曲线横向切割。要格外小心, 不要刺穿肝脏.
    7. 轻轻地将肠道移到动物和 #39; 左后腔静脉.
    8. 将纱布垫放在肝脏上, 然后将食指和中指放在肝脏上.
    9. 与另一只手, 插入针, 向上斜角, 进入中间静脉之间的肾血管的交界处和髂分岔.
    10. 在对肝脏施加压力时, 慢慢地取出血液.

Figure 4
图4。从后腔静脉取出血.

血液收集是一些涉及小鼠和老鼠的研究的共同要求。这些动物的血液提取方法的选择取决于许多因素, 如需要的血量、取样的频率、要流血的动物的健康状况以及技术员的技术水平.

在这里, 我们将审查这些考虑和概述血液收集程序, 包括复古眼眶眼出血, 尾巴剪和刻痕, 以及内血液收集。有关其他方法, 请参阅本系列的第二个视频.

在深入研究血液撤回协议之前, 让 & #39; 首先回顾一些一般的考虑, 包括样本类型, 选择针头, 以及可以收集的最大血容量。在从老鼠或老鼠身上采集血液之前, 必须确定所需的血样类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清.

如果收集全血, 必须在样品中加入抗凝剂以防止凝固。常用的抗凝剂包括肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸, 简称 EDTA。抗凝剂可以直接装入注射器, 以涂上表面。这就可以直接接触抗凝血, 因为血液被抽出来帮助预防血栓。由于啮齿动物的血液凝结迅速, 所以必须使用正确的抗凝血率。血浆采集需要用抗凝剂离心全血。自旋后, 白细胞和血小板层上方的半透明液体为等离子体。它包含纤维蛋白原和其他凝血因子。另一方面, 血清是从全血标本中收集的, 不含抗凝剂。由于样本已经凝固, 血清, 这是最高的球员, 不包含纤维蛋白原或其他凝血因子.

针的选择基于动物的大小和静脉穿刺部位。一般而言, 大口径的针头对血液细胞造成的损伤较小, 使血液收集更迅速;但更有可能造成船只损坏。针长也应考虑。如果针头太长, 使用起来可能会很笨拙, 或者血液可能在针头内开始凝结。大小的选择范围从18到29计, 0.5 到1.5 英寸的长度。每个方法的适当针大小将在 "过程" 部分中进行讨论.

最后, 由于啮齿类动物的体积很小, 因此可以从单一的采血中采集最多的血液, 这不会对机体造成严重伤害。血液提取可能没有或与液体替换-通常做使用0.9% 生理盐水。下面的文本协议中列出了每个案例的上限。此外, 一些实验需要多个样本收集, 在这种情况下, 与流体置换动物将需要时间之间的补充血液细胞以及。同样, 在串行收集期间可以收集最大数量的数据, 下面的协议中列出了上限值.

在复查了一些常规注意事项后, 让我们39; s 跳入特定的血液提取技术, 从回溯眼眶出血开始-科学家用来收集小体积从眼睛附近的血管的技术。注意, 在小鼠和老鼠之间, 轨道区域的解剖结构是不同的。老鼠有一个血管丛, 流在眼睛后面, 而老鼠有一个收集的血管, 创造一个复古的眼眶窦, 这使得它更容易执行这个过程中的小鼠.

从抓起一根管子采集血液开始。50-75 升的微压积管是首选。在工作表面放置几张纸巾或其他绝缘材料。这是为了保持动物和 #39; 在过程中的身体热量。现在麻醉的动物使用吸入麻醉剂, 如异氟醚。一旦动物被完全麻醉, 将其从腔中移除, 并将其置于侧卧床位置。接下来, 把手指放在头部的顶部和下颚线上, 把皮肤向后拉, 以引起眼部突起。避免对气管施加压力, 因为这可能导致窒息致死。随后, 将微红细胞压积管放置在眼睛的内侧眼角, 并将其直接尾在30至45度角上, 从机头的平面上。在轻轻旋转管子的同时施加压力。这将切割通过结膜膜和破裂的眼丛或鼻窦。血液会通过毛细管作用流入红细胞压积管。避免把管子推得如此深, 以至于你在眼球的后部打到了骨头。一旦血液开始流动, 保持压力保持眼睛凸出。停止流血, 释放皮肤, 让眼睛回到正常的位置。施加压力以促进止血。对于重复采样收集, 允许在出血之间至少10天。这为组织提供了一些愈合的时间.

虽然回溯式眼眶出血是一种常见的手术方法, 但对其仁爱有许多顾虑。这些包括肿胀由于过度运动的红细胞压积管。这反过来会导致眼球突出, 并阻碍眼睑闭合, 导致角膜干燥、损伤和疼痛, 这会引起抓挠和自残。不正确放置红细胞压积管可以切断视神经导致失明。另一个可能的并发症是眼睛可以从眼眶中被挤出, 让眼睑落在眼球后面。此外, 易碎的轨道骨骼的破裂, 眼球球体的穿透导致玻璃体的幽默消失, 或者眼睛后面的血肿形成会导致极度疼痛。尽管所有这些问题, 如果一个熟练的技术员执行的过程和动物完全麻醉, 复古眼眶出血是一种有效的方法收集血液中的啮齿动物.

现在让与 #39; s 检查尾部出血的注意事项和步骤, 以便收集小卷的序列样本。该程序所需的设备包括不育数11手术刀。剪刀不应使用, 因为剪刀的切割是粉碎, 这可以促进凝结和减少血液流动。其他仪器是一种限制管, 允许进入动物和 #39; s 尾巴;吸水纸巾;收集或红细胞压积管和止血粉-以帮助止血.

从保护动物进入约束管开始。然后, 用温水擦拭尾部, 去除碎片, 造成轻微的血管舒张。不要使用热水。延长尾巴, 用手术刀刀片剪下尾巴的末端, 用红细胞压积或收集管收集血液。尾巴可以被抚摸或 #34; 挤奶和 #34; 从臀部到鼻尖, 以鼓励血液流动。但是, 这将降低示例的质量.

停止出血, 用纱布垫将压力施加到尾部尖端。止血粉可用于止血。检查动物每5至10分钟, 以确保止血已达到, 这可能是在反复取样后延迟。从尾部切片收集的样本可以同时包含动脉和静脉血, 以及组织产品的污染。然而, 这一程序的血液收集允许的序列收集, 破坏的痂或血块的原始削减在尾部的末尾.

一种替代的采血方法对尾巴剪是尾巴船尼克, 是相对地较少侵入。为此, 使用相同的手术刀刀片, 使一个小切口直接超过侧尾静脉, 大约2/3 的距离从臀部。与尾部剪, 血液可以收集收集或红细胞压积管。对现场施加压力, 每5-10 分钟复核一次, 确保止血是必要的。然而, 与尾巴剪, 样品可能被污染与组织产品.

通常需要 non-survival 大样本的研究, 这是通过内出血或尾腔静脉失血完成的.

内方法在小鼠, 你需要一个3毫升注射器与 22-25 口径1英寸针。对于大鼠, 10-12 毫升注射器与18口径1.5 英寸针是首选。请参阅下面的协议, 了解为什么这些需求和注射器是理想的.

首先用二氧化碳安乐动物。继安乐死后, 将啮齿动物由颈背抱住, 身体垂垂。这种限制是至关重要的, 因为身体应该是直接的, 以防止心脏偏转或胸部扭曲。注意, 心脏近似地位于手肘的水平。插入侧在凹槽中, 刚好在剑的左侧, 平行于脊柱和肋骨下.

插入针, 向上倾斜, 进入胸腔, 刺穿心脏。用注射器轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器。等到血液填满桶后再增加压力。总血容量的大约一半可以通过心脏穿刺从老鼠或老鼠收集。这相当于大约1毫升的血液从一个普通的老鼠和大约10毫升的血液从一个普通的大鼠

一个替代的位置是背卧床时使用的横向方法。在这种情况下, 把针放在动物的肋骨和 #39 的左侧。入口点是根据胸壁上肘的点来测量的。插入针, 锥向上, 垂直于表的平面在一个点在胸壁的中点。使用注射器轻微的背压。如果针在心脏血液将流动入注射器。再次, 等待, 直到血液填补了桶前增加额外的背压。请注意, 在任一位置, 过度的背压可能会使心脏咬合, 使针锥和停止血流进入注射器.

收集心脏血液的另一种方法是通过尾腔静脉。这个过程需要的设备是适当的注射器与正确的大小针附有;用于打开腹腔的剪刀, 小创伤拇指钳和纱布海绵。这种技术要求动物被深深麻醉d 在整个手术过程中保持麻醉。CO2 麻醉不是一个选择, 因为动物的心脏必须在这个过程中跳动。将动物置于背卧床位置, 并将四肢固定在平台上。四肢应该远离身体.

现在用钳子将皮肤抬起, 用剪刀在女性的骨盆上方的皮肤上做一个小的横切口, 或者用雄性包皮。接下来, 把剪刀的点放到切口上, 通过骨盆或包皮向剑的皮肤中线切开。皮肤侧面反射, 抬起肌肉, 通过肌肉做一个小的横向切割, 就在皮肤切割的上面.

将剪刀的点放到腹部, 通过肌肉向剑进行中线切口。一定要向上角的剪刀点, 以防止切割任何器官。沿两侧肋骨的曲线横向切割。小心不要刺穿肝脏。轻轻地把肠子移到动物和 #39 上, 留下来露出后腔静脉。把纱布垫放在肝脏上, 然后把你的食指和中指放在上面。用你的另一只手, 插入针, 锥入腔静脉, 中间之间的连接肾血管和髂分岔。在肝脏上施加压力时, 慢慢地取出血液.

避免手的移动, 因为这可能会导致血管破裂。而且, 太快速的血液撤退可能导致船崩溃到斜面咬合打开和防止血液汇集。这项技术的主要优势是能够收集一个无菌样本, 因为针不通过皮肤.

最后, 让与 #39; 我们来看看这些血液提取技术的一些应用。免疫肿瘤学是一个新兴的领域, 这一领域的研究人员经常进行血液收集, 以研究癌症发展的不同阶段的免疫细胞。例如, 在这里, 研究人员收集了患癌的小鼠的心脏血液, 在肿瘤植入后十、二十和三十天内分离和量化中性粒细胞.

另一方面, 生理学也经常研究血液成分。就像在这项研究中, 研究人员对评估糖尿病动物的肾脏功能有兴趣。为了做到这一点, 这些科学家首先将染料注入到糖尿病动物模型中。接下来, 他们使用尾剪法收集血液中的血液中的染料浓度, 这最终用于计算肾小球滤过率, 突出了糖尿病患者肾脏功能的差异时点。归纳.

最后, 干细胞研究人员使用血样来评估将捐献细胞纳入接受者和 #39 系统的成功与否。在这里, 研究人员首先将雄性小鼠的骨髓细胞移植到野生型和经尾静脉注射的转基因雌性动物身上。接下来, 他们从接收鼠的逆行眼眶窦采集血液, 用聚合酶链反应研究血液细胞的基因组 DNA。这提供了在这两种动物中植入的捐献细胞的百分比.

您和 #39; 我刚刚看过朱庇特和 #39 的第一期关于血液提取技术的文章。请参阅下一视频系列, 以审查如何执行其他常用技术的血液收集实验室动物。一如既往, 感谢收看!

Summary

小鼠和老鼠的血液收集可以用各种技术来完成。虽然许多因素, 如样本大小, 抽样频率, 以及动物的大小和年龄影响这一点, 最重要的组成部分是技能水平的技术员执行样本收集。 对于这里所描述的方法, 正确使用麻醉剂对质量样品和动物的健康也是至关重要的.

References

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  3. Omaye, S.T., Skala, J.H., Gretz, M.D., Schaus, E.E., and Wade, C.E. 1987. Simple method for bleeding the unanaesthetized rat by tail venipuncture. Laboratory Animals. 21. 261-264.
  4. Adeghe, A.J-H. and Cohen, J. 1986. A better method for terminal bleeding of mice. Laboratory Animals. 20. 70-72.

1. 复古眶出血

  1. 设备
    1. 准备一个钟形罐, 或麻醉诱导室, 以管理麻醉气体, 如异氟醚。使用铃罐时, 液体麻醉剂必须与动物接触, 避免通过皮肤吸收。可以使用具有小孔的平台.
    2. 50-75 升的 Microhematocrit 管是首选。聚脂薄膜缠绕的管子不太可能在操作者的手指之间折断, 应被视为安全措施.
    3. 在工作表面上放置一些纸巾厚度或其他绝缘材料, 以维护动物和 #39; 在过程中的身体热.
  2. 动物的准备和定位
    1. 该动物用吸入麻醉剂 (如异氟醚) 在钟罐或气体麻醉感应室中麻醉, 以使其生效.
    2. 一旦该动物被完全麻醉, 它将被移除并放置在侧卧床.
    3. 眼睛通过将手指放在头部顶部和下颌上, 并将皮肤向后和向下拉.
    4. 避免对气管施加压力, 因为这可能会使气道塌陷或咬合窒息导致死亡.
  3. 血液提取
    1. microhematocrit 被放置在眼睛的内侧眼角, 并定向尾在30-45 和 #176; 从鼻子的平面角度.
    2. 在轻轻旋转红细胞压积管时施加压力。这将切割通过结膜膜和破裂的眼丛.
    3. 血液会通过毛细管作用流入红细胞压积管.
    4. 避免推挤得如此之深, 以至于你击中了眼腔后面的骨头.
    5. 一旦血液开始流动, 保持眼睛凸出的压力.
    6. 收集多管血, 没有必要把下一管进入眼丛, 因为血液将继续流动, 可以收集, 因为它来自内侧眼角.
    7. 停止出血, 释放皮肤, 让眼睛回到正常位置。将压力施加到轨道上以确保止血.

Figure 1
图1。小鼠眼眶内退血.

2. 尾部出血程序: 尾剪和尾尼克

  1. 设备
    1. 无菌手术刀刀片, 优选为11刀片或单面刀片, 用于对尾部切片方法进行初始截断。剪刀不应使用, 因为剪刀的切割是粉碎, 从而促进凝结和减少血液流动。为尾巴尼克做法, 一个数字11或15手术刀刀片被用来做切割.
    2. 允许对鼠标尾部进行访问的约束管.
    3. 吸水纸巾或纱布用作执行尾部切片的基板.
    4. 收集管或红细胞压积管也需要.
    5. 止血粉应可用于止血.
  2. 约束
    1. 将动物放在管子里, 这样尾巴就可以进入。对于布鲁姆型位, 动物先将臀部拉入试管。对于其他管子, 动物先放头.
    2. 动物被固定在管子里, 这样它们就不能掉头或撤回尾巴.
    3. 一些老鼠会允许尾巴剪和血液收集, 如果允许它们抓取粗糙的表面, 那么它们将会受到最小的人工约束.
    4. 有些老鼠需要吸入麻醉才能收集这种血液.
  3. 血液提取
    1. 尾部用温水擦除碎片, 造成轻微的血管舒张。不要使用热水.
    2. 为尾巴剪, 尾巴是延长的, 并且尾巴的非常末端 (0.5-1 毫米为老鼠和至多2毫米为老鼠) 用手术刀刀片切开.
    3. 为尾巴尼克, 尾巴是延长的, 并且切口是用手术刀刀片大约2/3 距离从臀部, 直接地在侧向尾巴静脉.
    4. 尾巴可以从臀部到鼻尖, 以鼓励血液流动; 但是, 这将降低样本的质量.
    5. 血液是从顶端或尼克收集的, 使用红细胞压积管或允许滴入收集瓶中.

3。心脏采血

  1. 设备
    1. 鼠标, 一个3毫升注射器与22-25 口径 x 1 和 #34; 针是首选。较小的注射器没有相同的背压, 可以使血液退出更困难。小于25的针头限制了血液的流动, 导致血细胞的凝结和损伤增加。短于1和 #34 的针; 当从隔膜接近时, 可能达不到心脏的水平.
    2. 对于大鼠, 10-12 毫升注射器与18口径 x 1.5 和 #34; 针是首选。根据大鼠的大小, 一个较小的注射器可能无法容纳整个血容量被收集, 因此注射器将不得不改变过程中。小于20口径的针头限制血液的流动, 导致血栓的增加。短于1.5 和 #34 的针; 当从隔膜接近时, 可能达不到心脏的水平.
    3. 一个足够大小的采血管用于保存收集的血液.
  2. 约束
    1. 适当的约束对此方法的成功至关重要。动物是由颈背持有, 身体垂直悬挂。重要的是, 身体要直接防止心脏的偏转或胸部扭曲.
    2. 另一种体位是背部卧床, 当把针放在动物的肋骨和 #39 的左侧。这是特别有用的大鼠或当多个动物将流血.

Figure 2
图2。用垂直保持的小鼠取出心脏血.

  1. 血液提取
    1. 从后部的方法, 穿刺膈更容易完成时, 鼠标或老鼠是垂直举行的颈背。
      1. 针在动物和 #39 左侧的凹槽中是先进的, 剑.
      2. 针应与脊柱平行, 并置于肋骨下方.
      3. 心脏近似地位于手肘的水平.
      4. 将针放在胸前, 刺穿心脏.
      5. 在注射器上施加轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器.
      6. 等到血液填满注射器后再在锡尔河上添加额外的背压英英.
    2. 来自动物和 #39 的侧向方法需要将动物定位在背卧床。
      1. 入口点是根据胸壁上肘部的点来测量的。心脏近似地位于手肘的水平.
      2. 针插入垂直于表的平面, 位于胸壁的中点, 如测量的 dorsoventrally.
      3. 将针放在胸前, 刺穿心脏.
      4. 在注射器上施加轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器.
      5. 等待直到血液填满注射器, 然后再在注射器上添加额外的背压.

Figure 3
图3。用小鼠在背卧床位置取出心脏血.

  1. 技术提示
    1. 正常的心脏位于与顶端指向左边。在罕见的情况下, 心脏可能被逆转, 导致困难刺穿心脏.
    2. 过度背压对注射器可能崩溃心脏, 咬合针斜面并且停止血液流动入注射器.
    3. 应用背压并反复释放它将在注射器中引发凝固.
    4. 轻轻按压肝脏可以迫使血液进入循环系统, 使其可供提取.

4。后腔静脉血流提取

  1. 设备
    1. 使用25-29 针的 TB 注射器用于在鼠标中收集血液。对于大鼠, 10-12 毫升注射器与22-25 口径 x 1 和 #34; 针是必需的.
    2. 手术平台, 解剖托盘, 或其他表面, 以确保动物是需要的, 连同领带, 磁带, 或引脚, 以固定四肢的位置.
    3. 注射麻醉或吸入麻醉是必要的。如果使用吸入麻醉, 这是可取的麻醉是通过一个精密的汽化器与鼻锥。程序长度是这样的, 使用感应室没有额外的麻醉气体交付将不会提供足够的时间来完成的血液撤退之前, 动物苏醒.
    4. 鼠标的虹膜剪刀, 或手术室尖锐钝剪刀的老鼠, 是需要的, 连同小创伤拇指钳, 和2和 #34; x 2 和 #34; 纱布海绵.
  2. 约束
    1. 当动物完全麻醉时, 由脚趾捏或尾捏决定, 动物被置于背卧床。
    2. 四肢通过磁带或针脚固定在平台上。四肢应该远离身体.
  3. 撤回
    1. 皮肤被解除, 一个小的横向切口是通过皮肤略高于骨盆的女性, 或略高于男性包皮。
    2. 将剪刀的点放在切口中, 中线切开是通过从骨盆/包皮到剑的皮肤进行的.
    3. 皮肤侧向两侧反射。钝性剥离可能是必要的, 以放松它的基础肌肉.
    4. 肌肉被解除, 一个小的横向削减是通过肌肉刚刚在皮肤切割.
    5. 将剪刀的点放在腹部, 中线切口通过肌肉剑。一定要角剪刀和 #39; 向上点, 以避免切割任何器官.
    6. 沿两侧肋骨的曲线横向切割。要格外小心, 不要刺穿肝脏.
    7. 轻轻地将肠道移到动物和 #39; 左后腔静脉.
    8. 将纱布垫放在肝脏上, 然后将食指和中指放在肝脏上.
    9. 与另一只手, 插入针, 向上斜角, 进入中间静脉之间的肾血管的交界处和髂分岔.
    10. 在对肝脏施加压力时, 慢慢地取出血液.

Figure 4
图4。从后腔静脉取出血.

血液收集是一些涉及小鼠和老鼠的研究的共同要求。这些动物的血液提取方法的选择取决于许多因素, 如需要的血量、取样的频率、要流血的动物的健康状况以及技术员的技术水平.

在这里, 我们将审查这些考虑和概述血液收集程序, 包括复古眼眶眼出血, 尾巴剪和刻痕, 以及内血液收集。有关其他方法, 请参阅本系列的第二个视频.

在深入研究血液撤回协议之前, 让 & #39; 首先回顾一些一般的考虑, 包括样本类型, 选择针头, 以及可以收集的最大血容量。在从老鼠或老鼠身上采集血液之前, 必须确定所需的血样类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清.

如果收集全血, 必须在样品中加入抗凝剂以防止凝固。常用的抗凝剂包括肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸, 简称 EDTA。抗凝剂可以直接装入注射器, 以涂上表面。这就可以直接接触抗凝血, 因为血液被抽出来帮助预防血栓。由于啮齿动物的血液凝结迅速, 所以必须使用正确的抗凝血率。血浆采集需要用抗凝剂离心全血。自旋后, 白细胞和血小板层上方的半透明液体为等离子体。它包含纤维蛋白原和其他凝血因子。另一方面, 血清是从全血标本中收集的, 不含抗凝剂。由于样本已经凝固, 血清, 这是最高的球员, 不包含纤维蛋白原或其他凝血因子.

针的选择基于动物的大小和静脉穿刺部位。一般而言, 大口径的针头对血液细胞造成的损伤较小, 使血液收集更迅速;但更有可能造成船只损坏。针长也应考虑。如果针头太长, 使用起来可能会很笨拙, 或者血液可能在针头内开始凝结。大小的选择范围从18到29计, 0.5 到1.5 英寸的长度。每个方法的适当针大小将在 "过程" 部分中进行讨论.

最后, 由于啮齿类动物的体积很小, 因此可以从单一的采血中采集最多的血液, 这不会对机体造成严重伤害。血液提取可能没有或与液体替换-通常做使用0.9% 生理盐水。下面的文本协议中列出了每个案例的上限。此外, 一些实验需要多个样本收集, 在这种情况下, 与流体置换动物将需要时间之间的补充血液细胞以及。同样, 在串行收集期间可以收集最大数量的数据, 下面的协议中列出了上限值.

在复查了一些常规注意事项后, 让我们39; s 跳入特定的血液提取技术, 从回溯眼眶出血开始-科学家用来收集小体积从眼睛附近的血管的技术。注意, 在小鼠和老鼠之间, 轨道区域的解剖结构是不同的。老鼠有一个血管丛, 流在眼睛后面, 而老鼠有一个收集的血管, 创造一个复古的眼眶窦, 这使得它更容易执行这个过程中的小鼠.

从抓起一根管子采集血液开始。50-75 升的微压积管是首选。在工作表面放置几张纸巾或其他绝缘材料。这是为了保持动物和 #39; 在过程中的身体热量。现在麻醉的动物使用吸入麻醉剂, 如异氟醚。一旦动物被完全麻醉, 将其从腔中移除, 并将其置于侧卧床位置。接下来, 把手指放在头部的顶部和下颚线上, 把皮肤向后拉, 以引起眼部突起。避免对气管施加压力, 因为这可能导致窒息致死。随后, 将微红细胞压积管放置在眼睛的内侧眼角, 并将其直接尾在30至45度角上, 从机头的平面上。在轻轻旋转管子的同时施加压力。这将切割通过结膜膜和破裂的眼丛或鼻窦。血液会通过毛细管作用流入红细胞压积管。避免把管子推得如此深, 以至于你在眼球的后部打到了骨头。一旦血液开始流动, 保持压力保持眼睛凸出。停止流血, 释放皮肤, 让眼睛回到正常的位置。施加压力以促进止血。对于重复采样收集, 允许在出血之间至少10天。这为组织提供了一些愈合的时间.

虽然回溯式眼眶出血是一种常见的手术方法, 但对其仁爱有许多顾虑。这些包括肿胀由于过度运动的红细胞压积管。这反过来会导致眼球突出, 并阻碍眼睑闭合, 导致角膜干燥、损伤和疼痛, 这会引起抓挠和自残。不正确放置红细胞压积管可以切断视神经导致失明。另一个可能的并发症是眼睛可以从眼眶中被挤出, 让眼睑落在眼球后面。此外, 易碎的轨道骨骼的破裂, 眼球球体的穿透导致玻璃体的幽默消失, 或者眼睛后面的血肿形成会导致极度疼痛。尽管所有这些问题, 如果一个熟练的技术员执行的过程和动物完全麻醉, 复古眼眶出血是一种有效的方法收集血液中的啮齿动物.

现在让与 #39; s 检查尾部出血的注意事项和步骤, 以便收集小卷的序列样本。该程序所需的设备包括不育数11手术刀。剪刀不应使用, 因为剪刀的切割是粉碎, 这可以促进凝结和减少血液流动。其他仪器是一种限制管, 允许进入动物和 #39; s 尾巴;吸水纸巾;收集或红细胞压积管和止血粉-以帮助止血.

从保护动物进入约束管开始。然后, 用温水擦拭尾部, 去除碎片, 造成轻微的血管舒张。不要使用热水。延长尾巴, 用手术刀刀片剪下尾巴的末端, 用红细胞压积或收集管收集血液。尾巴可以被抚摸或 #34; 挤奶和 #34; 从臀部到鼻尖, 以鼓励血液流动。但是, 这将降低示例的质量.

停止出血, 用纱布垫将压力施加到尾部尖端。止血粉可用于止血。检查动物每5至10分钟, 以确保止血已达到, 这可能是在反复取样后延迟。从尾部切片收集的样本可以同时包含动脉和静脉血, 以及组织产品的污染。然而, 这一程序的血液收集允许的序列收集, 破坏的痂或血块的原始削减在尾部的末尾.

一种替代的采血方法对尾巴剪是尾巴船尼克, 是相对地较少侵入。为此, 使用相同的手术刀刀片, 使一个小切口直接超过侧尾静脉, 大约2/3 的距离从臀部。与尾部剪, 血液可以收集收集或红细胞压积管。对现场施加压力, 每5-10 分钟复核一次, 确保止血是必要的。然而, 与尾巴剪, 样品可能被污染与组织产品.

通常需要 non-survival 大样本的研究, 这是通过内出血或尾腔静脉失血完成的.

内方法在小鼠, 你需要一个3毫升注射器与 22-25 口径1英寸针。对于大鼠, 10-12 毫升注射器与18口径1.5 英寸针是首选。请参阅下面的协议, 了解为什么这些需求和注射器是理想的.

首先用二氧化碳安乐动物。继安乐死后, 将啮齿动物由颈背抱住, 身体垂垂。这种限制是至关重要的, 因为身体应该是直接的, 以防止心脏偏转或胸部扭曲。注意, 心脏近似地位于手肘的水平。插入侧在凹槽中, 刚好在剑的左侧, 平行于脊柱和肋骨下.

插入针, 向上倾斜, 进入胸腔, 刺穿心脏。用注射器轻微的背压。如果针在心脏, 血液将流入注射器。等到血液填满桶后再增加压力。总血容量的大约一半可以通过心脏穿刺从老鼠或老鼠收集。这相当于大约1毫升的血液从一个普通的老鼠和大约10毫升的血液从一个普通的大鼠

一个替代的位置是背卧床时使用的横向方法。在这种情况下, 把针放在动物的肋骨和 #39 的左侧。入口点是根据胸壁上肘的点来测量的。插入针, 锥向上, 垂直于表的平面在一个点在胸壁的中点。使用注射器轻微的背压。如果针在心脏血液将流动入注射器。再次, 等待, 直到血液填补了桶前增加额外的背压。请注意, 在任一位置, 过度的背压可能会使心脏咬合, 使针锥和停止血流进入注射器.

收集心脏血液的另一种方法是通过尾腔静脉。这个过程需要的设备是适当的注射器与正确的大小针附有;用于打开腹腔的剪刀, 小创伤拇指钳和纱布海绵。这种技术要求动物被深深麻醉d 在整个手术过程中保持麻醉。CO2 麻醉不是一个选择, 因为动物的心脏必须在这个过程中跳动。将动物置于背卧床位置, 并将四肢固定在平台上。四肢应该远离身体.

现在用钳子将皮肤抬起, 用剪刀在女性的骨盆上方的皮肤上做一个小的横切口, 或者用雄性包皮。接下来, 把剪刀的点放到切口上, 通过骨盆或包皮向剑的皮肤中线切开。皮肤侧面反射, 抬起肌肉, 通过肌肉做一个小的横向切割, 就在皮肤切割的上面.

将剪刀的点放到腹部, 通过肌肉向剑进行中线切口。一定要向上角的剪刀点, 以防止切割任何器官。沿两侧肋骨的曲线横向切割。小心不要刺穿肝脏。轻轻地把肠子移到动物和 #39 上, 留下来露出后腔静脉。把纱布垫放在肝脏上, 然后把你的食指和中指放在上面。用你的另一只手, 插入针, 锥入腔静脉, 中间之间的连接肾血管和髂分岔。在肝脏上施加压力时, 慢慢地取出血液.

避免手的移动, 因为这可能会导致血管破裂。而且, 太快速的血液撤退可能导致船崩溃到斜面咬合打开和防止血液汇集。这项技术的主要优势是能够收集一个无菌样本, 因为针不通过皮肤.

最后, 让与 #39; 我们来看看这些血液提取技术的一些应用。免疫肿瘤学是一个新兴的领域, 这一领域的研究人员经常进行血液收集, 以研究癌症发展的不同阶段的免疫细胞。例如, 在这里, 研究人员收集了患癌的小鼠的心脏血液, 在肿瘤植入后十、二十和三十天内分离和量化中性粒细胞.

另一方面, 生理学也经常研究血液成分。就像在这项研究中, 研究人员对评估糖尿病动物的肾脏功能有兴趣。为了做到这一点, 这些科学家首先将染料注入到糖尿病动物模型中。接下来, 他们使用尾剪法收集血液中的血液中的染料浓度, 这最终用于计算肾小球滤过率, 突出了糖尿病患者肾脏功能的差异时点。归纳.

最后, 干细胞研究人员使用血样来评估将捐献细胞纳入接受者和 #39 系统的成功与否。在这里, 研究人员首先将雄性小鼠的骨髓细胞移植到野生型和经尾静脉注射的转基因雌性动物身上。接下来, 他们从接收鼠的逆行眼眶窦采集血液, 用聚合酶链反应研究血液细胞的基因组 DNA。这提供了在这两种动物中植入的捐献细胞的百分比.

您和 #39; 我刚刚看过朱庇特和 #39 的第一期关于血液提取技术的文章。请参阅下一视频系列, 以审查如何执行其他常用技术的血液收集实验室动物。一如既往, 感谢收看!

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