Retrait de sang J’ai

Lab Animal Research

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Overview

< classe p = « jove_content » > Source : Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR ; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Université de Notre Dame, IN

collecte de sang est une exigence commune pour les études de recherche qui impliquent des souris et des rats. La méthode de prélèvement de sang chez des rats et des souris dépend de la quantité de sang nécessaire, la fréquence de l’échantillonnage, l’état de santé de l’animal à être saigné et le niveau de compétence du technicien. 1 tous les saignements de méthodes discutées-rétro-orbitaire sinus, saignements de snip queue initiale et intracardiaque saigne-nécessite l’utilisation d’une anesthésie générale.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Essentiel de la recherche sur les animaux de laboratoire. Retrait de sang J’ai. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

< classe p = « jove_content » > avant la procédure de purge, le type d’échantillon nécessaire doit être déterminé. Il faudra effectuer des procédures expérimentales sang total, sérum ou plasma. Pour le sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon. Plasma, qui contient le fibrinogène et autres facteurs de coagulation lorsque séparé de globules rouges, peut être extraites d’un échantillon d’anticoagulé. Sérum est obtenu par prélèvement sanguin sans anticoagulant. Le sérum résulteront de centrifugation de l’échantillon une fois qu’un caillot s’est formé. Comme l’exemple a coagulé, le sérum ne contient pas de fibrinogène ou autres facteurs de coagulation. Sérum et le plasma sont obtenues à l’aide d’une centrifugeuse courue à 2200-2500 tr/min pour un minimum de 15 minutes.

< classe p = « jove_content » > pour obtenir un exemple qui doit céder le sang total ou plasma, un anticoagulant approprié doit être utilisé. Les anticoagulants couramment utilisés pour les animaux de laboratoire sont l’héparine, citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) ; sélection dont est issue des besoins de recherche. Séquestrer une forme liquide d’EDTA, héparine et citrate de sodium-peut être chargé directement dans la seringue pour enduire les surfaces. Cela permet le contact de l’anticoagulant directement lorsque le sang est tiré, aidant dans la prévention de la coagulation. Comme le rat des caillots de sang plus rapidement que le sang plus chez les mammifères, il est essentiel que le bon ratio d’anticoagulant à sang soit utilisée pour la collecte de sang.

< classe p = « jove_content » > aiguille sélection est basée sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, plus le diamètre de l’aiguille, plus vite l’échantillon peut être collecté. Moins de dommages pour les cellules sanguines est un autre avantage à grandes AIG. Toutefois, le principal inconvénient d’aiguilles de gros calibre est des dommages potentiels causés au navire. Sur les rats et les souris, les choix du calibre des aiguilles de calibre de 20 à 29 qui sont de 0,5 à 1,5 pouces de longueur. Si une aiguille est trop longue, non seulement est-il difficile à utiliser, mais ayant de l’espace supplémentaire dans l’aiguille pourrait entraîner la coagulation. La taille de l’aiguille appropriée est répertoriée pour chaque méthode dans la section procédures.

< classe p = « jove_content » > la taille de l’échantillon requis doit également être prédéterminée. En raison de l’exiguïté de la souris ou le rat, le montant maximal de prélèvement de sang doit être calculé pour un saignement de la survie. Une souris moyenne 25 grammes a un volume de sang total de 1,8 ml ; le rat moyen pesant 250 grammes a un volume de sang total de 16 ml. Pour obtenir un exemple simple de sang sur une souris ou un rat sans le remplacement des liquides, le volume maximal de sang qui peut être enlevé en toute sécurité est de 10 % du volume sanguin total, ou 7.7-8 µl/g. Ainsi pour une souris moyenne, 10 % de son volume sanguin est de 193-200 µl. Pour un rat moyen de 250 grammes, cela équivaut à 1,9-2,0 ml. des études ont montré que l’enlève plus de 15 % du volume sanguin peut causer un choc hypovolémique. 1, 2, avec remplacement liquidien, jusqu'à 15 % du volume sanguin total- ou 12 µl/g-peut être supprimé. Pour une souris de 25 grammes, cela équivaut à 300 µl ; pour un rat de 250 grammes, il est équivalent à 3 ml. Pour remplacer les liquides, les liquides doivent être réchauffés et sous-cutanée.

< classe p = « jove_content » > s’il est nécessaire de prélever des échantillons multiples, réduire le volume de sang tiré. Le volume maximal de sang qui peut-être être dessiné par semaine est pas plus de 7,5 % du volume sanguin total, ou 6 µl/g. Pour une souris de 25 grammes, cela revient à 145-150 µl par semaine. Pour un rat de 250 grammes, cela revient à 1,45 à 1,50 ml par semaine. Si le prélèvement aura lieu toutes les 2 semaines, jusqu'à concurrence de 10 % du volume sanguin total (8 µl/g) peut-être être dessiné. C’est équivalent à 200 µl toutes les 2 semaines pour une souris moyenne et jusqu'à 2,00 ml toutes les 2 semaines pour un rat de 250 grammes. Une étude effectuée sur des rats avec un poids moyen de 250 grammes, a révélé que lorsque les volumes sanguins de 15 à 20 % ont été supprimés, il a fallu plus de 29 jours, pour les niveaux sanguins de normaliser. 1, 2 pour la collecte de sang répétées, remplacement liquidien ne permet pas pour un plus grand volume de sang ou de la collecte de sang plus fréquente, car il ne remplace que volume. L’animal aura besoin de temps pour reconstituer les cellules sanguines.

< classe p = « jove_content » > l’utilisation du plexus rétro-orbitaire est une pratique courante dans le passé. Cependant, beaucoup de préoccupations concernant la cruauté de cette procédure sont apparus. Au cours de la procédure, un mouvement excessif du tube hématocrite une fois placé dans le canthus médial de le œil peut endommager les tissus environnants, ce qui entraîne un gonflement des paupières et/ou des membranes conjonctivales. Les tissus enflés peuvent causer le globe oculaire saillie assez loin pour que la fermeture de la paupière est entravée, potentiellement entraînant un séchage cornéen et l’endommager. Douleur de gonflement peut déclencher des rayures et l’automutilation qui résulte en une énucléation de l’oeil. Une mauvaise mise en place du tube hématocrite au cours d’une hémorragie rétro-orbitaire peut rompre le nerf optique, entraînant la cécité. Si le tube de l’hématocrite est avancé à un mauvais angle, le œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet des paupières tomber derrière le globe oculaire. Dans ce cas, il est très difficile de remplacer correctement l’oeil dans la douille. Autres problèmes qui peuvent survenir incluent la fracturation des os fragiles orbite, pénétration du globe oculaire entraînant la perte de vitré, ou la formation d’un hématome derrière le œil qui peut se traduire par une douleur extrême en raison de la pression sur le œil et de ses environs Ouvrages d’art. Malgré tous ces soucis, si un technicien effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié avec une anesthésie générale, comme l’isoflurane inhalant anesthésie, rétro-orbitaire hémorragie s’est avéré être une méthode efficace de sang collection chez les rongeurs.

< classe p = « jove_content » > la structure anatomique de la zone orbitale est différente entre la souris et le rat. La souris a la rétro-orbitaire sinus-une collection de bateaux qui créent un sinus dans la zone orbitale. Dans l’orbite de l’oeil de rat, il y a un plexus de navires qui coulent derrière cet oeil ; Toutefois, ils ne forment pas un sinus, comme dans la souris. Par conséquent, il est plus facile d’effectuer cette procédure sur des souris. Pour la collecte d’échantillonnage répété par l’intermédiaire du plexus rétro-orbitaire, un minimum de 10 jours entre saigne est nécessaire pour permettre les tissus dans la zone à guérir. Bien que l’anesthésie générale est recommandé, la procédure peut être effectuée chez les souris sans anesthésie générale si un anesthésique topique ophtalmique, tels que proparacaïne ou tétracaïne, est appliqué avant l’intervention. Comme les rats n’ont pas le sinus rétro-orbitaire, et parce que leurs membranes autour de l’orbite sont beaucoup plus forts, il est obligatoire de les anesthésier pour cette procédure.

< classe p = « jove_content » > séries échantillons d’un faible volume peuvent être obtenus en utilisant une méthode d’attache de queue. La première amputation de la queue doit être limitée à un bout de la queue, environ 0,5 à 1,0 mm de longueur chez les souris et rats de 2,0 mm. 1 que la procédure de capture de queue pour prélèvement sanguin permet pour les collections de la série en perturbant la tavelure ou caillot de l’original coupé à l’extrémité de la queue. Amputation supplémentaire de la pointe de la queue n’est généralement pas nécessaire. Volumes de sang recueilli gamme de 20 à 100 µL de souris et de 75-150 µL forats de r. Le montant perçu est variable entre les animaux et peut être influencé par l’âge, l’état de santé et le poids.

< classe p = « jove_content » > l’échantillon prélevé dans un snip queue peut contenir de sang artériel et veineux, ainsi que de la contamination des tissus produits. La qualité de l’échantillon diminue si la queue est caressée ou « traites » pour obtenir plus de sang. Pour augmenter le flux sanguin, la queue peut être chauffée avec des compresses chaudes, une lampe chauffante ou l’immersion dans l’eau tiède. La pression doit être appliquée à l’extrémité de la queue pour l’hémostase, et animaux doit être vérifiée toutes les 5-10 minutes afin d’assurer l’hémostase a été atteint. Hémostase est souvent retardée avec échantillonnage répété. Une poudre styptique peut être utilisée pour l’hémostase. Pour la première amputation, anesthésie (générale ou locale) est recommandé. Saignement ultérieur ne devrait pas nécessiter l’anesthésie, autant que les animaux deviennent habitués à la procédure. L’anesthésie provoquera une chute de tension artérielle, ce qui rend difficile le prélèvement de sang avec cette technique.

< classe p = « jove_content » > une alternative à un snip de queue est le Pseudo de navire de queue. Cette procédure est facilement réalisée sur des souris et des rats. Cependant, comme avec le snip de queue, les échantillons peuvent être contaminées avec des produits de tissus, en particulier chez la souris. Pour les rats, une aiguille hypodermique est insérée dans le vaisseau, et le sang est prélevé de la station de l’aiguille. Une étude a démontré l’utilisation d’un tourniquet placé au-dessus du site de ponction de l’aiguille afin d’aider à la collecte de sang. 3 Une seringue n’est pas utilisée pour dessiner le sang hors du récipient, comme la pression engendrée de la seringue s’effondrera le navire. Cette méthode peut aussi servir pour série d’échantillonnage, un caillot peut être enlevé pour provoquer le site de saigner à nouveau. Comme avec des cisailles de queue, il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et revérifier l’animal toutes les 5-10 minutes.

études exigent souvent, un nonsurvival, un échantillon de sang importante qui est recueillie par exsanguination via une purge intracardiaque ou la veine cave caudale. 4 environ la moitié du volume total de sang peuvent être collectée par ponction cardiaque d’une souris ou un rat. Cela revient à 40 µl/g ou environ 1 ml, pour une moyenne de 25 grammes de souris. Un rat de 250 grammes, produirait environ 10 ml de sang. Les animaux doivent être anesthésiés pour exsanguination. Inhalant anesthésie ou CO 2 narcose peut être utilisé par un technicien compétent ; injectable anesthésie peut également être utilisé. Toutefois, il peut y avoir une diminution de la pression artérielle et la circulation, ce qui pourrait diminuer la quantité de sang prélevé.

< classe p = « jove_content » > la méthode de la veine cave caudale exige que l’animal être profondément anesthésiés pour exposer chirurgicalement le navire. CO 2 narcose n’est pas suffisant, car le cœur doit être battu et l’animal respiratoires durant le prélèvement de sang. Au cours de la procédure, trop rapide du prélèvement de sang peut causer le navire de s’effondrer sur le biseau de la seringue, occlusion de la collection de sang ouverture et prévention. En outre, les parois des vaisseaux sont minces, et ainsi le mouvement de la main et l’aiguille doit être évité pour prévenir une rupture ou une fuite de sang provenant du site d’entrée de l’aiguille. Que l’aiguille n’est pas en passant à travers la peau, cette méthode se traduit par le prélèvement d’un échantillon stérile. Méthodes d’euthanasie appoint doivent être employés pour s’assurer que l’animal ne récupère pas d’anesthésie. Cette méthode est souvent suivie d’une perfusion cardiaque ou aortique.

la méthode intracardiaque peut être effectué soit avec l’animal immobilisé manuellement une fois que c’est anesthésié (méthode fermée), ou le cœur peut être chirurgicalement exposé conformément au protocole pour la veine cave caudale sang (méthode) collection méthode ouverte). Pour la méthode fermée, les points de repère pour le placement de l’aiguille sont le sillon formé par la cage thoracique au processus xiphoïde, côté gauche de l’animal.

Procedure

1. rétro-orbitaire bleed

jar
  1. matériel
    1. Prepare une cloche, ou chambre de l’induction anesthésique, d’administrer un gaz anesthésique comme l’isoflurane. Lorsque vous utilisez une cloche de verre, il est impératif que l’anesthésie liquide n’entre pas en contact avec l’animal, pour éviter l’absorption par la peau. Une plate-forme avec de petits trous peut être utilisée.
    2. Tubes Microhematocrit qui détiennent 50-75 microlitres est préférés. Mylar enveloppé de tubes sont moins susceptibles de rompre entre les doigts de l’opérateur et doivent être considérés comme une mesure de sécurité.
    3. Plusieurs épaisseurs de serviette de papier ou d’autres matériaux isolants, est placés sur la surface de travail pour maintenir l’animal ' chaleur du corps au cours de la procédure s.
  2. Préparation et positionnement de l’animal
    1. l’animal est anesthésié avec une anesthésique, comme l’isoflurane, dans une chambre d’induction anesthésie cloche de verre ou de gaz à effet d’inhalation.
    2. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, il est enlevé et placé en décubitus latéral.
    3. Le œil est dépassait en plaçant un doigt sur le dessus de la tête et le long de la mâchoire et en tirant la peau en arrière et vers le bas.
    4. Éviter exerçant une pression sur la trachée, car qui peut s’effondrer ou occlure les voies respiratoires causant la mort par asphyxie.
  3. Retrait de sang
    1. le microhematocrit est placé dans le canthus médial de le œil et dirigé en direction caudale à un angle de 30-45° de l’avion du nez.
    2. Appliquer la pression tout en tournant doucement le tube de l’hématocrite. Cela coupera à travers les membranes conjonctivales et rompent le plexus oculaire.
    3. Le sang s’écoule dans le tube de l’hématocrite par capillarité.
    4. Éviter de pousser si profond que vous frappez l’os à l’arrière de la cavité oculaire.
    5. Une fois que le sang commence à couler, maintenir la pression pour garder l’oeil dépassait.
    6. Pour collecter plusieurs tubes de sang, il n’est pas nécessaire de placer le prochain tube dans le plexus oculaire, car le sang continuera à couler et peuvent être collectées comme il vient du canthus médial.
    7. Pour arrêter le saignement, relâcher la peau et laisser l’oeil revenir à la position normale. Exercez une pression sur l’orbite afin d’assurer l’hémostase.

Figure 1
figure 1. Retrait de sang orbitale rétro chez les souris.

2. procédures de purge de queue : snip de queue et de la queue nick

  1. matériel
    1. A lame de bistouri stériles, de préférence une lame numéro 11 ou une lame de rasoir simple face, sert à fabriquer l’amputation initiale pour la méthode de capture de queue. Ciseaux ne doit pas être utilisé parce que la coupe faite par ciseaux est écrasant, ce qui favorise la coagulation et en réduisant la circulation sanguine. Pour la procédure de nick de queue, une lame de bistouri n° 11 ou 15 est utilisée pour faire la coupe.
    2. Un tube de retenue qui permet d’accéder à la queue de la souris est préparé à.
    3. Serviettes en papier absorbant ou une gaze sont utilisés comme substrat pour l’exécution de la capture de queue.
    4. Tubes de prélèvement ou de tubes de l’hématocrite sont également tenus.
    5. Poudre styptique devrait bénéficier de l’aide dans l’hémostase.
  2. Retenue
    1. l’animal est placé dans le tube de telle sorte que la queue est accessible. Pour Broome retardateurs de type, l’animal est tiré croupion tout d’abord dans le tube. Pour les autres tubes, l’animal est placé tête première.
    2. Animaux est sécurisés dans le tube, tels qu’ils ne peuvent pas faire demi-tour ou retirer la queue.
    3. Certaines souris permettra à la collection de snip et le sang de queue avec un minimum de retenue manuelle s’ils sont autorisés à saisir une surface rugueuse.
    4. Certains rats exigera l’anesthésie par inhalation pour cette méthode de collecte de sang.
  3. Retrait de sang
    1. la queue est frottée avec l’eau tiède pour enlever les débris et provoquer une légère vasodilatation. N’utilisez pas d’eau chaude.
    2. Pour la capture de la queue, la queue est étendue, et la fin de la queue (0,5 à 1 mm pour souris et jusqu'à 2 mm pour les rats) est coupée avec la lame de bistouri.
    3. Pour le nick de la queue, la queue est étendue, et une incision est faite avec la lame de bistouri Swann-Morton environ 2/3 la distance de la croupe, directement au-dessus de la veine caudale latéral.
    4. La queue peut être tracée de rumsteck à la pointe pour favoriser la circulation sanguine ; cependant, cela va diminuer la qualité de l’échantillon.
    5. Le sang est prélevé de la pointe ou le nick en utilisant des tubes de l’hématocrite ou autorisé au goutte à goutte dans un flacon de collection.

3. Prélèvement sanguin cardiaque

    1. d’équipement pour une souris, un 3 cc seringue avec un calibre 22-25 x 1 " aiguille est préféré. Seringues plus petites n’ont pas la même pression arrière et peuvent rendre plus difficile les prélèvement de sang. Aiguilles à moins de 25 gauge restreint la circulation du sang, conduisant à une augmentation de la coagulation et endommagent les cellules sanguines. Aiguilles plus courtes que 1 " peut ne pas atteindre le niveau du cœur lorsque vous approchez du diaphragme.
    2. Pour un rat, une seringue de cc 10-12 avec un calibre 18 x 1,5 " aiguille est préféré. Selon la taille du rat, une seringue plus petite ne peut-être pas avoir le volume de sang entier à percevoir, et donc la seringue devra être modifiée au cours de la procédure. Aiguilles à moins de 20 gauge restreignent la circulation du sang, conduisant à une augmentation de la coagulation. Aiguilles plus courtes que 1,5 " peut ne pas atteindre le niveau du cœur lorsque vous approchez du diaphragme.
    3. Un tube de prélèvement de sang de taille suffisante est utilisé pour contenir le sang recueilli.
  1. Retenue
    1. retenue appropriée est essentielle au succès de cette méthode. L’animal est détenu par la peau du cou avec le corps suspendu verticalement. Il est important que le corps soit directement à empêcher la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine.
    2. Une autre position est le décubitus dorsal lorsque vous placez l’aiguille entre les nervures sur l’animal ' s côté gauche. Ceci est particulièrement utile pour les très gros rats ou lorsque plusieurs animaux doivent être saignés.

Figure 2
figure 2. Prélèvement de sang cardiaque avec souris maintenu verticalement.

  1. retrait de sang
    1. l’approche de la face postérieure, la perforation de la membrane est plus facilement réalisable lorsque la souris ou le rat est maintenu verticalement par la peau du cou.
      1. L’aiguille est avancée dans l’encoche située juste à gauche de l’animal ' xiphoid s.
      2. L’aiguille doit être parallèle à la colonne vertébrale et placé juste sous les côtes.
      3. Coeur est situé approximativement au niveau du coude.
      4. Placer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur.
      5. Appliquer dos légère pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue.
      6. D’attente jusqu'à ce que le sang a rempli la seringue avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire sur le syrInge.
    2. L’approche latérale de l’animal ' s côté gauche nécessite l’animal de positionnement en décubitus dorsal.
      1. Le point d’entrée est mesurée sur la pointe du coude sur la paroi thoracique. Le cœur est situé approximativement au niveau du coude.
      2. L’aiguille est insérée perpendiculaire au plan de la table à un point situé à mi-chemin sur la paroi thoracique mesurée dorsoventralement.
      3. Placer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur.
      4. Appliquer dos légère pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue.
      5. Attendre jusqu'à ce que le sang a rempli la seringue avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire sur la seringue.

Figure 3
figure 3. Prélèvement de sang cardiaque avec la souris en position de décubitus dorsal.

  1. conseils techniques
    1. cœur normal se trouve avec l’apex pointant vers la gauche. Dans de rares cas, le cœur peut être inversé, résultant en difficulté à percer le cœur.
    2. Dos excessive sur la seringue, la pression risque de s’effondrer au cœur, obstruant le biseau de l’aiguille et l’arrêt de la circulation sanguine dans la seringue.
    3. Application contre-pression et relâchez-le à plusieurs reprises amorcera la coagulation dans la seringue.
    4. Doucement exerçant une pression sur le foie peut forcer le volume de sang supplémentaire dans le système circulatoire, ce qui en fait disponible pour le retrait.

4. Prélèvement de sang veine cave postérieure

  1. matériel
    1. TB A seringue avec une aiguille de calibre 25-29 est utilisé pour la collecte de sang chez la souris. Pour les rats, une seringue de cc 10-12 avec un calibre 22-25 x 1 " aiguille est nécessaire.
    2. Une plate-forme chirurgicale, plateau de dissection ou toute autre surface pour garantir l’animal est nécessaire, ainsi que des liens, une bande ou épingles pour fixer les branches en position.
    3. Injectable anesthésie ou anesthésie par inhalation n’est nécessaire. Si vous utilisez l’anesthésie par inhalation, il est souhaitable que l’anesthésique livrés via un vaporisateur de précision avec un cône de nez. La longueur de la procédure est telle qu’à l’aide d’une chambre à induction sans livraison supplémentaire gaz anesthésique ne fournira pas suffisamment de temps pour achever le retrait de sang avant que l’animal ravive.
    4. Iris ciseaux pour la souris, ou ciseaux pointue-arrondie de salle d’opération pour le rat, est nécessaires, ainsi que la pince pouce petit atraumatique et un 2 " x 2 " de gaze.
  2. Retenue
    1. lorsque l’animal est complètement anesthésié, tel que déterminé par le pincement de l’orteil ou le pincement de la queue, l’animal est placé en décubitus dorsal.
    2. Membres sont fixés à la plate-forme avec du sparadrap ou des épingles. Il convient d’étendre les membres du corps.
  3. Retrait
    1. la peau se soulève et une petite coupe transversale est faite à travers la peau juste au-dessus du bassin chez les femelles, ou juste au dessus du prépuce chez les hommes.
    2. Le point des ciseaux est placé dans la coupe, et une incision médiane est faite à travers la peau du prépuce/bassin de la xiphoïde.
    3. La peau témoigne latéralement de chaque côté. Par dissection par clivage peut être nécessaire de desserrer le muscle sous-jacent.
    4. Le muscle est levé, et une petite coupe transversale est faite à travers le muscle juste au-dessus de la coupe de la peau.
    5. Le point des ciseaux est placé dans l’abdomen et une incision médiane est faite à travers le muscle à la xiphoïde. N’oubliez pas des ciseaux d’angle ' point vers le haut pour éviter de couper les organes.
    6. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Faire preuve de prudence supplémentaire ne pas à percer le foie.
    7. Déplacer doucement l’intestin de l’animal ' s gauche pour exposer la veine cave postérieure.
    8. Placer une compresse sur le foie et l’index et le médius de repos sur le foie.
    9. Avec l’autre main, introduire l’aiguille, biseau vers le haut, dans la veine cave supérieure, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et de la bifurcation iliaque.
    10. Retirer lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Figure 4
figure 4. Retrait de la veine cave postérieure de sang.

la collecte de sang est une exigence commune pour plusieurs travaux de recherche qui impliquent des souris et des rats. Le choix de la méthode de prélèvement de sang chez ces animaux est tributaire de nombreux facteurs comme, le volume de sang nécessaire, fréquence de l’échantillonnage, l’état de santé de l’animal à être saigné et le niveau de compétence du technicien.

Ici, nous passerons en revue ces considérations et contour procédures de collecte de sang y compris la purge d’oeil rétro-orbitaire, queue cisailles et pseudos, ainsi que de la collecte de sang intracardiaque. Pour les autres méthodes, voir la deuxième vidéo de cette série.

avant de plonger dans les protocoles de sevrage de sang, laissez ' s examiner tout d’abord quelques considérations générales, y compris le type d’échantillon, la sélection de l’aiguille et le volume maximal de sang peut être collectées. Avant de prélever le sang d’une souris ou un rat, le type d’échantillon de sang nécessaire doit être déterminé. Des procédures expérimentales pourraient exiger de sang total, plasma ou sérum.

Si la collecte de sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon pour éviter la coagulation. Les anticoagulants courants incluent héparine, citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique, abrégé en EDTA. Les anticoagulants peuvent être chargés directement dans la seringue pour enduire les surfaces. Cela permet le contact de l’anticoagulant directement lorsque le sang est tiré à l’aidant dans la prévention de la coagulation. Parce que des caillots sanguins rongeurs rapidement, il est essentiel que le bon ratio d’anticoagulant à sang soit utilisée. Collecte de plasma nécessite centrifugation du sang total avec anticoagulant. Après l’essorage, le liquide translucide au-dessus de la couche WBC et plaquettaire est plasma. Il contient le fibrinogène et autres facteurs de coagulation. En revanche, sérum prélevé les anticoagulants de sans échantillon sang entier. Et parce que l’échantillon a coagulé, le sérum, qui est le meilleur joueur, ne contient-elle pas de fibrinogène ou autres facteurs de coagulation.

Aiguille sélection est basée sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, les aiguilles de grosse perce moins endommager les cellules sanguines et activent la collecte de sang plus rapide ; mais sont plus susceptibles de causer des lésions vasculaires. On envisagera également la longueur de l’aiguille. Si une aiguille est trop longue, il pourrait être difficile à utiliser, ou sang pourrait commencer à coaguler encore à l’intérieur de l’aiguille. Le choix de la taille varie de 18 à 29 jauge et 0,5 à 1,5 pouces de longueur. La taille de l’aiguille appropriée pour chaque méthode sera discutée dans la section procédures.

Enfin, en raison de la petite taille des rongeurs, il y a une quantité maximale de sang qui peut être prélevé sur un tirage au sort simple de sang, qui ne causera pas de préjudice grave à l’organisme. Prélèvement de sang pourrait être sans ou avec remplacement liquidien - fait généralement à l’aide de sérum physiologique 0,9 %. La limite supérieure dans chaque cas est répertoriée dans le protocole de texte ci-dessous. En outre, certaines expériences nécessitent plusieurs prélèvement et dans ces cas ainsi que remplacement liquidien animal aura besoin de temps entre les deux pour reconstituer les cellules de sang aussi bien. Encore une fois, il existe un montant maximal pouvant être collectées au cours de la série collection, et les limites supérieures sont énumérés dans le protocole ci-dessous.

après avoir lu quelques considérations générales, laissez & #39 ; s sauter dans les techniques de retrait de sang spécifiques, commençant par rétro-orbitaire hémorragie - une technique utilisée par les scientifiques pour recueillir des petits volumes des navires près de le œil. Notez que la structure anatomique de la zone orbitale est différente entre la souris et le rat. Les rats ont un plexus de navires qui coulent derrière le œil, tandis que la souris a une collection de bateaux qui créent un sinus orbital rétro, qui fait il est plus facile d’effectuer cette procédure chez les souris.

Begin en saisissant un tube de prélèvement sanguin. Tubes de micro hématocrite qui détiennent 50-75 microlitres sont préférés. Prévoir plusieurs serviettes en papier ou d’autres matériaux isolants sur la surface de travail. Il s’agit de maintenir l’animal ' chaleur corporelle s au cours de la procédure. Maintenant anesthésier l’animal à l’aide d’une anesthésique comme l’isoflurane inhalation. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-la de la chambre et placez-le vers le bas sur le côté qui est en position de décubitus latéral. Ensuite, placer un doigt sur le dessus de la tête et le long de la ligne de la mâchoire et tirer la peau vers l’arrière et vers le bas pour induire la protrusion oculaire. Évitez d’appliquer la pression la trachée car qui peut causer la mort par asphyxie. Par la suite, placer le tube de micro-hématocrite dans le canthus médial de le œil et de l’orienter direction caudale à un angle de 30 à 45 degrés de l’avion du nez. Appliquer une pression tout en tournant doucement le tube. Cela coupera à travers les membranes conjonctivales et rompent le plexus oculaire ou des sinus. Le sang s’écoule dans le tube de l’hématocrite par capillarité. Éviter de pousser le tube si profond que vous frappez l’os à l’arrière de la cavité oculaire. Une fois que le sang commence à couler, maintenir la pression pour garder l’oeil dépassait. Pour arrêter l’hémorragie, relâcher la peau et laisser l’oeil revenir à la position normale. Faire pression pour favoriser l’hémostase. Pour le prélèvement d’échantillons répétés, prévoyez un minimum de 10 jours entre les saignements. Ceci fournit des tissus quelque temps à guérir.

Bien que rétro-orbitaire hémorragie est une procédure courante, il y a beaucoup de préoccupations concernant son humanité. Il s’agit d’un gonflement dû à un mouvement excessif du tube hématocrite. Cela peut à son tour provoquer la saillie du globe oculaire et empêcher la fermeture de la paupière résultant dans la cornée séchage, dommages et douleur, qui peut déclencher les rayures et l’automutilation. Une mauvaise mise en place du tube hématocrite peut rompre le nerf optique entraînant la cécité. Une autre complication possible est que le œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet des paupières tomber derrière le globe oculaire. En outre, des questions peuvent se poser de la fracturation des os fragiles orbite, pénétration du globe oculaire entraînant la perte du corps vitré, ou la formation d’un hématome derrière le œil qui peut se traduire par des douleurs extrêmes. Malgré tous ces soucis, si un technicien effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié, hémorragie rétro-orbitaire est une méthode efficace de collecte de sang chez les rongeurs.

maintenant laisser ' s examiner les considérations et les modalités de la queue des saignements, qui permet la collecte d’une série des échantillons de petits volumes. L’équipement nécessaire pour cette procédure inclut un scalpel stérile numéro 11. Ciseaux ne doit pas être utilisé parce que la coupe faite par ciseaux est écrasant, qui peut favoriser la coagulation et réduire la circulation sanguine. Autres instruments sont un tube de retenue qui permet d’accéder à l’animal ' queue de s ; serviettes en papier absorbant ; tubes de collecte ou de l’hématocrite et poudre styptique - pour aider à l’hémostase.

Démarrer en sécurisant l’animal dans le tube de retenue. Ensuite, essuyez la queue à l’eau tiède pour enlever les débris et provoque une légère vasodilatation. N’utilisez pas d’eau chaude. Étendre la queue et avec la lame de bistouri, couper le bout de la queue pour recueillir le sang à l’aide de tubes hématocrite ou collection. La queue peut être tracée ou " traites " de rumsteck à la pointe pour favoriser la circulation sanguine. Toutefois, cela diminuera la qualité de l’échantillon.

D’arrêter saignement, exercer de pression sur l’extrémité de la queue avec un tampon de gaze. La poudre styptique peut servir à atteindre l’hémostase. Vérifier les animaux chaque 5 à 10 minutes afin d’assurer l’hémostase est parvenu, qui pourrait être retardée après échantillonnage répété. L’échantillon prélevé dans un snip queue peut contenir de sang artériel et veineux, ainsi que de la contamination des tissus produits. Toutefois, cette procédure pour le prélèvement sanguin permet pour les collections de la série en perturbant la tavelure ou caillot de la coupe originale à l’extrémité de la queue.

Une méthode de collecte de sang alternative à un snip de queue est le Pseudo de navire de queue, qui est relativement moins invasif. Pour ce faire, en utilisant la même lame de bistouri Swann-Morton, faire une petite coupe directement sur la veine latérale arrière, environ deux-tiers la distance de la croupe. Comme avec des cisailles de queue, sang peut être collecté dans la collection ou des tubes de l’hématocrite. Et il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et revérifier l’animal toutes les 5-10 minutes. Cependant, comme avec le snip de queue, les échantillons peuvent être contaminés par produits tissues.

souvent les études nécessitant un échantillon de sang grand sans survie, qui est accompli à travers exsanguination via une purge intracardiaque ou la veine cave caudale.

Pour méthode intracardiaque chez la souris, vous avez besoin d’une seringue cc 3 avec une aiguille de 1 pouce de calibre de 22 -25. Et pour les rats, un 10-12 cc seringue avec une aiguille de 18 calibre 1,5 pouces est préféré. Voir le protocole ci-dessous pour comprendre le pourquoi ces besoins et les seringues sont idéales.

Début d’euthanasier l’animal à l’aide de dioxyde de carbone. Suite à l’euthanasie, tenez le rongeur par la peau du cou avec le corps suspendu verticalement. Cette retenue est critique car le corps doit être tout droit pour éviter la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine. Notez que le cœur est situé approximativement au niveau du coude. Le côté d’insertion est dans l’encoche située juste à gauche de la xiphoïde, parallèle à la colonne vertébrale et sous les côtes.

Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur. Appliquer une légère contre-pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue. Attendez que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Environ la moitié du volume sanguin total peut être prélevée une souris ou un rat par ponction cardiaque. Cela équivaut à environ 1 mL de sang de souris moyenne d’environ 10 mL de sang chez un rat moyen

une autre position est le décubitus dorsal lorsque vous utilisez l’approche latérale. Dans ce cas, placez l’aiguille entre les nervures sur l’animal ' s côté gauche. Le point d’entrée est mesuré sur la pointe du coude sur la paroi thoracique. Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, perpendiculaire au plan de la table à un point situé à mi-chemin sur la paroi thoracique. Appliquez une légère pression arrière avec la seringue. Si l’aiguille se trouve dans le sang du cœur s’écoule dans la seringue. Encore une fois, attendez jusqu'à ce que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Remarque que dans les deux positions, contre-pression excessive risque de s’effondrer au cœur obstruant le biseau de l’aiguille et l’arrêt de la circulation sanguine dans la seringue.

Une autre méthode pour recueillir le sang cardiaque est par l’intermédiaire de la veine cave caudale. Le matériel nécessaire pour cette procédure sont une seringue appropriée avec une aiguille de taille correcte, attachée ; ciseaux pour l’ouverture de la cavité abdominale, atraumatique petit pouce éponge de forceps et de gaze. Cette technique nécessite que l’animal être profondément anesthésiés und maintenue sous anesthésie tout au long de la procédure. Narcose de CO2 n’est pas une option, car le cœur animal doit se battre pour cette procédure. Mettre l’animal en position de décubitus dorsal et fixer les branches à la plate-forme. Il convient d’étendre les membres du corps.

Maintenant soulever la peau avec une pince et utiliser des ciseaux pour faire une petite coupe transversale à travers la peau juste au-dessus du bassin dans le prépuce chez les mâles ou de femelles. Ensuite, placez le point des ciseaux dans la coupe et faire une incision médiane à travers la peau dans le bassin ou le prépuce à la xiphoïde. Avec la peau reflétée latéralement, soulevez le muscle et faire une petite coupe transversale à travers le muscle, juste au-dessus de la coupe de la peau.

Placer le point du ciseaux dans l’abdomen et faire une incision médiane à travers le muscle à la xiphoïde. N’oubliez pas du point de ciseaux vers le haut pour éviter un quelconque des organes de coupe d’angle. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Veillez à ne pas perforer le foie. Déplacez doucement les intestins de l’animal ' s gauche pour exposer la veine cave postérieure. Placez une compresse sur le foie et reposer votre index et le majeur à ce sujet. Avec votre autre main, introduire l’aiguille, biseau vers le haut dans la veine cave, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et de la bifurcation iliaque. Retirer lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Eviter

mouvement de main, que pourrait causer la rupture du navire. Aussi, prélèvement de sang trop rapide peut provoquer le navire de s’effondrer sur le biseau obstruant la collecte de sang ouverture et prévention. Le principal avantage de cette technique est la capacité de recueillir un échantillon stérile parce que l’aiguille ne traverse pas la peau.

Enfin, laissez ' s coup d’oeil à certaines applications de ces techniques de retrait de sang. Immuno-oncologie est un domaine émergent, et chercheurs dans ce domaine souvent effectuent des prélèvements sanguins pour étudier les cellules immunitaires à différents stades de développement du cancer. Par exemple, ici des chercheurs ont recueilli sang cardiaque chez des souris porteuses du cancer à isoler et à quantifier les neutrophiles à dix, vingt et trente jours après la prise de greffe tumorale.

Sang d’autre part, la composition est également fréquemment étudiés par les physiologistes. Comme dans cette étude, chercheurs se sont intéressés à évaluer la fonction rénale chez les animaux diabétiques. Pour ce faire, ces scientifiques a tout d’abord injecté un colorant dans un modèle animal du diabète. Ensuite, ils ont ensuite utilisé queue snip méthode pour recueillir le sang à plusieurs points de temps pour évaluer la concentration de colorant dans le sang, qui a été finalement utilisée pour calculer le taux de filtration glomérulaire qui a mis en évidence la différence de la fonction rénale après diabète induction.

Enfin, cellules chercheurs utilisation des échantillons de sang pour évaluer la réussite de l’incorporation de cellules du donneur dans le destinataire de la tige ' système s. Ici, les enquêteurs ont transplanté tout d’abord des cellules de moelle osseuse de souris mâles dans un type sauvage et animal femelle génétiquement modifié via l’injection dans la veine queue. Ensuite, ils ont recueilli le sang le sinus rétro orbital de la souris destinataire afin d’étudier l’ADN génomique des cellules sanguines à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase. Cela a fourni le pourcentage de la prise de la greffe de cellules du donneur dans les deux types d’animaux.

vous ' ve juste regardé JoVE ' première tranche s sur les techniques de retrait de sang. S’il vous plaît voir la vidéo suivante dans la série d’examiner comment effectuer autres techniques couramment utilisés de collecte de sang chez les animaux de laboratoire. Comme toujours, Merci de regarder !

Summary

< classe p = « jove_content » > collecte de sang pour souris et rats peut être accompli avec une variété de techniques. Bien que de nombreux facteurs, tels que la taille de l’échantillon, la fréquence d’échantillonnage et la taille et l’âge de l’animal influencent, la composante la plus importante est le niveau de compétence du technicien effectuant le prélèvement des échantillons. Pour les méthodes décrites ici, la bonne utilisation des anesthésiques est également cruciale pour des échantillons de qualité et le bien-être des animaux.

References

  1. Guidelines for the survival bleeding of mice and rats. 2010.
  2. Diehl, K.H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.M., and van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practical guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21. 15-23.
  3. Omaye, S.T., Skala, J.H., Gretz, M.D., Schaus, E.E., and Wade, C.E. 1987. Simple method for bleeding the unanaesthetized rat by tail venipuncture. Laboratory Animals. 21. 261-264.
  4. Adeghe, A.J-H. and Cohen, J. 1986. A better method for terminal bleeding of mice. Laboratory Animals. 20. 70-72.

1. rétro-orbitaire bleed

jar
  1. matériel
    1. Prepare une cloche, ou chambre de l’induction anesthésique, d’administrer un gaz anesthésique comme l’isoflurane. Lorsque vous utilisez une cloche de verre, il est impératif que l’anesthésie liquide n’entre pas en contact avec l’animal, pour éviter l’absorption par la peau. Une plate-forme avec de petits trous peut être utilisée.
    2. Tubes Microhematocrit qui détiennent 50-75 microlitres est préférés. Mylar enveloppé de tubes sont moins susceptibles de rompre entre les doigts de l’opérateur et doivent être considérés comme une mesure de sécurité.
    3. Plusieurs épaisseurs de serviette de papier ou d’autres matériaux isolants, est placés sur la surface de travail pour maintenir l’animal ' chaleur du corps au cours de la procédure s.
  2. Préparation et positionnement de l’animal
    1. l’animal est anesthésié avec une anesthésique, comme l’isoflurane, dans une chambre d’induction anesthésie cloche de verre ou de gaz à effet d’inhalation.
    2. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, il est enlevé et placé en décubitus latéral.
    3. Le œil est dépassait en plaçant un doigt sur le dessus de la tête et le long de la mâchoire et en tirant la peau en arrière et vers le bas.
    4. Éviter exerçant une pression sur la trachée, car qui peut s’effondrer ou occlure les voies respiratoires causant la mort par asphyxie.
  3. Retrait de sang
    1. le microhematocrit est placé dans le canthus médial de le œil et dirigé en direction caudale à un angle de 30-45° de l’avion du nez.
    2. Appliquer la pression tout en tournant doucement le tube de l’hématocrite. Cela coupera à travers les membranes conjonctivales et rompent le plexus oculaire.
    3. Le sang s’écoule dans le tube de l’hématocrite par capillarité.
    4. Éviter de pousser si profond que vous frappez l’os à l’arrière de la cavité oculaire.
    5. Une fois que le sang commence à couler, maintenir la pression pour garder l’oeil dépassait.
    6. Pour collecter plusieurs tubes de sang, il n’est pas nécessaire de placer le prochain tube dans le plexus oculaire, car le sang continuera à couler et peuvent être collectées comme il vient du canthus médial.
    7. Pour arrêter le saignement, relâcher la peau et laisser l’oeil revenir à la position normale. Exercez une pression sur l’orbite afin d’assurer l’hémostase.

Figure 1
figure 1. Retrait de sang orbitale rétro chez les souris.

2. procédures de purge de queue : snip de queue et de la queue nick

  1. matériel
    1. A lame de bistouri stériles, de préférence une lame numéro 11 ou une lame de rasoir simple face, sert à fabriquer l’amputation initiale pour la méthode de capture de queue. Ciseaux ne doit pas être utilisé parce que la coupe faite par ciseaux est écrasant, ce qui favorise la coagulation et en réduisant la circulation sanguine. Pour la procédure de nick de queue, une lame de bistouri n° 11 ou 15 est utilisée pour faire la coupe.
    2. Un tube de retenue qui permet d’accéder à la queue de la souris est préparé à.
    3. Serviettes en papier absorbant ou une gaze sont utilisés comme substrat pour l’exécution de la capture de queue.
    4. Tubes de prélèvement ou de tubes de l’hématocrite sont également tenus.
    5. Poudre styptique devrait bénéficier de l’aide dans l’hémostase.
  2. Retenue
    1. l’animal est placé dans le tube de telle sorte que la queue est accessible. Pour Broome retardateurs de type, l’animal est tiré croupion tout d’abord dans le tube. Pour les autres tubes, l’animal est placé tête première.
    2. Animaux est sécurisés dans le tube, tels qu’ils ne peuvent pas faire demi-tour ou retirer la queue.
    3. Certaines souris permettra à la collection de snip et le sang de queue avec un minimum de retenue manuelle s’ils sont autorisés à saisir une surface rugueuse.
    4. Certains rats exigera l’anesthésie par inhalation pour cette méthode de collecte de sang.
  3. Retrait de sang
    1. la queue est frottée avec l’eau tiède pour enlever les débris et provoquer une légère vasodilatation. N’utilisez pas d’eau chaude.
    2. Pour la capture de la queue, la queue est étendue, et la fin de la queue (0,5 à 1 mm pour souris et jusqu'à 2 mm pour les rats) est coupée avec la lame de bistouri.
    3. Pour le nick de la queue, la queue est étendue, et une incision est faite avec la lame de bistouri Swann-Morton environ 2/3 la distance de la croupe, directement au-dessus de la veine caudale latéral.
    4. La queue peut être tracée de rumsteck à la pointe pour favoriser la circulation sanguine ; cependant, cela va diminuer la qualité de l’échantillon.
    5. Le sang est prélevé de la pointe ou le nick en utilisant des tubes de l’hématocrite ou autorisé au goutte à goutte dans un flacon de collection.

3. Prélèvement sanguin cardiaque

    1. d’équipement pour une souris, un 3 cc seringue avec un calibre 22-25 x 1 " aiguille est préféré. Seringues plus petites n’ont pas la même pression arrière et peuvent rendre plus difficile les prélèvement de sang. Aiguilles à moins de 25 gauge restreint la circulation du sang, conduisant à une augmentation de la coagulation et endommagent les cellules sanguines. Aiguilles plus courtes que 1 " peut ne pas atteindre le niveau du cœur lorsque vous approchez du diaphragme.
    2. Pour un rat, une seringue de cc 10-12 avec un calibre 18 x 1,5 " aiguille est préféré. Selon la taille du rat, une seringue plus petite ne peut-être pas avoir le volume de sang entier à percevoir, et donc la seringue devra être modifiée au cours de la procédure. Aiguilles à moins de 20 gauge restreignent la circulation du sang, conduisant à une augmentation de la coagulation. Aiguilles plus courtes que 1,5 " peut ne pas atteindre le niveau du cœur lorsque vous approchez du diaphragme.
    3. Un tube de prélèvement de sang de taille suffisante est utilisé pour contenir le sang recueilli.
  1. Retenue
    1. retenue appropriée est essentielle au succès de cette méthode. L’animal est détenu par la peau du cou avec le corps suspendu verticalement. Il est important que le corps soit directement à empêcher la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine.
    2. Une autre position est le décubitus dorsal lorsque vous placez l’aiguille entre les nervures sur l’animal ' s côté gauche. Ceci est particulièrement utile pour les très gros rats ou lorsque plusieurs animaux doivent être saignés.

Figure 2
figure 2. Prélèvement de sang cardiaque avec souris maintenu verticalement.

  1. retrait de sang
    1. l’approche de la face postérieure, la perforation de la membrane est plus facilement réalisable lorsque la souris ou le rat est maintenu verticalement par la peau du cou.
      1. L’aiguille est avancée dans l’encoche située juste à gauche de l’animal ' xiphoid s.
      2. L’aiguille doit être parallèle à la colonne vertébrale et placé juste sous les côtes.
      3. Coeur est situé approximativement au niveau du coude.
      4. Placer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur.
      5. Appliquer dos légère pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue.
      6. D’attente jusqu'à ce que le sang a rempli la seringue avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire sur le syrInge.
    2. L’approche latérale de l’animal ' s côté gauche nécessite l’animal de positionnement en décubitus dorsal.
      1. Le point d’entrée est mesurée sur la pointe du coude sur la paroi thoracique. Le cœur est situé approximativement au niveau du coude.
      2. L’aiguille est insérée perpendiculaire au plan de la table à un point situé à mi-chemin sur la paroi thoracique mesurée dorsoventralement.
      3. Placer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur.
      4. Appliquer dos légère pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue.
      5. Attendre jusqu'à ce que le sang a rempli la seringue avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire sur la seringue.

Figure 3
figure 3. Prélèvement de sang cardiaque avec la souris en position de décubitus dorsal.

  1. conseils techniques
    1. cœur normal se trouve avec l’apex pointant vers la gauche. Dans de rares cas, le cœur peut être inversé, résultant en difficulté à percer le cœur.
    2. Dos excessive sur la seringue, la pression risque de s’effondrer au cœur, obstruant le biseau de l’aiguille et l’arrêt de la circulation sanguine dans la seringue.
    3. Application contre-pression et relâchez-le à plusieurs reprises amorcera la coagulation dans la seringue.
    4. Doucement exerçant une pression sur le foie peut forcer le volume de sang supplémentaire dans le système circulatoire, ce qui en fait disponible pour le retrait.

4. Prélèvement de sang veine cave postérieure

  1. matériel
    1. TB A seringue avec une aiguille de calibre 25-29 est utilisé pour la collecte de sang chez la souris. Pour les rats, une seringue de cc 10-12 avec un calibre 22-25 x 1 " aiguille est nécessaire.
    2. Une plate-forme chirurgicale, plateau de dissection ou toute autre surface pour garantir l’animal est nécessaire, ainsi que des liens, une bande ou épingles pour fixer les branches en position.
    3. Injectable anesthésie ou anesthésie par inhalation n’est nécessaire. Si vous utilisez l’anesthésie par inhalation, il est souhaitable que l’anesthésique livrés via un vaporisateur de précision avec un cône de nez. La longueur de la procédure est telle qu’à l’aide d’une chambre à induction sans livraison supplémentaire gaz anesthésique ne fournira pas suffisamment de temps pour achever le retrait de sang avant que l’animal ravive.
    4. Iris ciseaux pour la souris, ou ciseaux pointue-arrondie de salle d’opération pour le rat, est nécessaires, ainsi que la pince pouce petit atraumatique et un 2 " x 2 " de gaze.
  2. Retenue
    1. lorsque l’animal est complètement anesthésié, tel que déterminé par le pincement de l’orteil ou le pincement de la queue, l’animal est placé en décubitus dorsal.
    2. Membres sont fixés à la plate-forme avec du sparadrap ou des épingles. Il convient d’étendre les membres du corps.
  3. Retrait
    1. la peau se soulève et une petite coupe transversale est faite à travers la peau juste au-dessus du bassin chez les femelles, ou juste au dessus du prépuce chez les hommes.
    2. Le point des ciseaux est placé dans la coupe, et une incision médiane est faite à travers la peau du prépuce/bassin de la xiphoïde.
    3. La peau témoigne latéralement de chaque côté. Par dissection par clivage peut être nécessaire de desserrer le muscle sous-jacent.
    4. Le muscle est levé, et une petite coupe transversale est faite à travers le muscle juste au-dessus de la coupe de la peau.
    5. Le point des ciseaux est placé dans l’abdomen et une incision médiane est faite à travers le muscle à la xiphoïde. N’oubliez pas des ciseaux d’angle ' point vers le haut pour éviter de couper les organes.
    6. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Faire preuve de prudence supplémentaire ne pas à percer le foie.
    7. Déplacer doucement l’intestin de l’animal ' s gauche pour exposer la veine cave postérieure.
    8. Placer une compresse sur le foie et l’index et le médius de repos sur le foie.
    9. Avec l’autre main, introduire l’aiguille, biseau vers le haut, dans la veine cave supérieure, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et de la bifurcation iliaque.
    10. Retirer lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Figure 4
figure 4. Retrait de la veine cave postérieure de sang.

la collecte de sang est une exigence commune pour plusieurs travaux de recherche qui impliquent des souris et des rats. Le choix de la méthode de prélèvement de sang chez ces animaux est tributaire de nombreux facteurs comme, le volume de sang nécessaire, fréquence de l’échantillonnage, l’état de santé de l’animal à être saigné et le niveau de compétence du technicien.

Ici, nous passerons en revue ces considérations et contour procédures de collecte de sang y compris la purge d’oeil rétro-orbitaire, queue cisailles et pseudos, ainsi que de la collecte de sang intracardiaque. Pour les autres méthodes, voir la deuxième vidéo de cette série.

avant de plonger dans les protocoles de sevrage de sang, laissez ' s examiner tout d’abord quelques considérations générales, y compris le type d’échantillon, la sélection de l’aiguille et le volume maximal de sang peut être collectées. Avant de prélever le sang d’une souris ou un rat, le type d’échantillon de sang nécessaire doit être déterminé. Des procédures expérimentales pourraient exiger de sang total, plasma ou sérum.

Si la collecte de sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon pour éviter la coagulation. Les anticoagulants courants incluent héparine, citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique, abrégé en EDTA. Les anticoagulants peuvent être chargés directement dans la seringue pour enduire les surfaces. Cela permet le contact de l’anticoagulant directement lorsque le sang est tiré à l’aidant dans la prévention de la coagulation. Parce que des caillots sanguins rongeurs rapidement, il est essentiel que le bon ratio d’anticoagulant à sang soit utilisée. Collecte de plasma nécessite centrifugation du sang total avec anticoagulant. Après l’essorage, le liquide translucide au-dessus de la couche WBC et plaquettaire est plasma. Il contient le fibrinogène et autres facteurs de coagulation. En revanche, sérum prélevé les anticoagulants de sans échantillon sang entier. Et parce que l’échantillon a coagulé, le sérum, qui est le meilleur joueur, ne contient-elle pas de fibrinogène ou autres facteurs de coagulation.

Aiguille sélection est basée sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, les aiguilles de grosse perce moins endommager les cellules sanguines et activent la collecte de sang plus rapide ; mais sont plus susceptibles de causer des lésions vasculaires. On envisagera également la longueur de l’aiguille. Si une aiguille est trop longue, il pourrait être difficile à utiliser, ou sang pourrait commencer à coaguler encore à l’intérieur de l’aiguille. Le choix de la taille varie de 18 à 29 jauge et 0,5 à 1,5 pouces de longueur. La taille de l’aiguille appropriée pour chaque méthode sera discutée dans la section procédures.

Enfin, en raison de la petite taille des rongeurs, il y a une quantité maximale de sang qui peut être prélevé sur un tirage au sort simple de sang, qui ne causera pas de préjudice grave à l’organisme. Prélèvement de sang pourrait être sans ou avec remplacement liquidien - fait généralement à l’aide de sérum physiologique 0,9 %. La limite supérieure dans chaque cas est répertoriée dans le protocole de texte ci-dessous. En outre, certaines expériences nécessitent plusieurs prélèvement et dans ces cas ainsi que remplacement liquidien animal aura besoin de temps entre les deux pour reconstituer les cellules de sang aussi bien. Encore une fois, il existe un montant maximal pouvant être collectées au cours de la série collection, et les limites supérieures sont énumérés dans le protocole ci-dessous.

après avoir lu quelques considérations générales, laissez & #39 ; s sauter dans les techniques de retrait de sang spécifiques, commençant par rétro-orbitaire hémorragie - une technique utilisée par les scientifiques pour recueillir des petits volumes des navires près de le œil. Notez que la structure anatomique de la zone orbitale est différente entre la souris et le rat. Les rats ont un plexus de navires qui coulent derrière le œil, tandis que la souris a une collection de bateaux qui créent un sinus orbital rétro, qui fait il est plus facile d’effectuer cette procédure chez les souris.

Begin en saisissant un tube de prélèvement sanguin. Tubes de micro hématocrite qui détiennent 50-75 microlitres sont préférés. Prévoir plusieurs serviettes en papier ou d’autres matériaux isolants sur la surface de travail. Il s’agit de maintenir l’animal ' chaleur corporelle s au cours de la procédure. Maintenant anesthésier l’animal à l’aide d’une anesthésique comme l’isoflurane inhalation. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-la de la chambre et placez-le vers le bas sur le côté qui est en position de décubitus latéral. Ensuite, placer un doigt sur le dessus de la tête et le long de la ligne de la mâchoire et tirer la peau vers l’arrière et vers le bas pour induire la protrusion oculaire. Évitez d’appliquer la pression la trachée car qui peut causer la mort par asphyxie. Par la suite, placer le tube de micro-hématocrite dans le canthus médial de le œil et de l’orienter direction caudale à un angle de 30 à 45 degrés de l’avion du nez. Appliquer une pression tout en tournant doucement le tube. Cela coupera à travers les membranes conjonctivales et rompent le plexus oculaire ou des sinus. Le sang s’écoule dans le tube de l’hématocrite par capillarité. Éviter de pousser le tube si profond que vous frappez l’os à l’arrière de la cavité oculaire. Une fois que le sang commence à couler, maintenir la pression pour garder l’oeil dépassait. Pour arrêter l’hémorragie, relâcher la peau et laisser l’oeil revenir à la position normale. Faire pression pour favoriser l’hémostase. Pour le prélèvement d’échantillons répétés, prévoyez un minimum de 10 jours entre les saignements. Ceci fournit des tissus quelque temps à guérir.

Bien que rétro-orbitaire hémorragie est une procédure courante, il y a beaucoup de préoccupations concernant son humanité. Il s’agit d’un gonflement dû à un mouvement excessif du tube hématocrite. Cela peut à son tour provoquer la saillie du globe oculaire et empêcher la fermeture de la paupière résultant dans la cornée séchage, dommages et douleur, qui peut déclencher les rayures et l’automutilation. Une mauvaise mise en place du tube hématocrite peut rompre le nerf optique entraînant la cécité. Une autre complication possible est que le œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet des paupières tomber derrière le globe oculaire. En outre, des questions peuvent se poser de la fracturation des os fragiles orbite, pénétration du globe oculaire entraînant la perte du corps vitré, ou la formation d’un hématome derrière le œil qui peut se traduire par des douleurs extrêmes. Malgré tous ces soucis, si un technicien effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié, hémorragie rétro-orbitaire est une méthode efficace de collecte de sang chez les rongeurs.

maintenant laisser ' s examiner les considérations et les modalités de la queue des saignements, qui permet la collecte d’une série des échantillons de petits volumes. L’équipement nécessaire pour cette procédure inclut un scalpel stérile numéro 11. Ciseaux ne doit pas être utilisé parce que la coupe faite par ciseaux est écrasant, qui peut favoriser la coagulation et réduire la circulation sanguine. Autres instruments sont un tube de retenue qui permet d’accéder à l’animal ' queue de s ; serviettes en papier absorbant ; tubes de collecte ou de l’hématocrite et poudre styptique - pour aider à l’hémostase.

Démarrer en sécurisant l’animal dans le tube de retenue. Ensuite, essuyez la queue à l’eau tiède pour enlever les débris et provoque une légère vasodilatation. N’utilisez pas d’eau chaude. Étendre la queue et avec la lame de bistouri, couper le bout de la queue pour recueillir le sang à l’aide de tubes hématocrite ou collection. La queue peut être tracée ou " traites " de rumsteck à la pointe pour favoriser la circulation sanguine. Toutefois, cela diminuera la qualité de l’échantillon.

D’arrêter saignement, exercer de pression sur l’extrémité de la queue avec un tampon de gaze. La poudre styptique peut servir à atteindre l’hémostase. Vérifier les animaux chaque 5 à 10 minutes afin d’assurer l’hémostase est parvenu, qui pourrait être retardée après échantillonnage répété. L’échantillon prélevé dans un snip queue peut contenir de sang artériel et veineux, ainsi que de la contamination des tissus produits. Toutefois, cette procédure pour le prélèvement sanguin permet pour les collections de la série en perturbant la tavelure ou caillot de la coupe originale à l’extrémité de la queue.

Une méthode de collecte de sang alternative à un snip de queue est le Pseudo de navire de queue, qui est relativement moins invasif. Pour ce faire, en utilisant la même lame de bistouri Swann-Morton, faire une petite coupe directement sur la veine latérale arrière, environ deux-tiers la distance de la croupe. Comme avec des cisailles de queue, sang peut être collecté dans la collection ou des tubes de l’hématocrite. Et il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et revérifier l’animal toutes les 5-10 minutes. Cependant, comme avec le snip de queue, les échantillons peuvent être contaminés par produits tissues.

souvent les études nécessitant un échantillon de sang grand sans survie, qui est accompli à travers exsanguination via une purge intracardiaque ou la veine cave caudale.

Pour méthode intracardiaque chez la souris, vous avez besoin d’une seringue cc 3 avec une aiguille de 1 pouce de calibre de 22 -25. Et pour les rats, un 10-12 cc seringue avec une aiguille de 18 calibre 1,5 pouces est préféré. Voir le protocole ci-dessous pour comprendre le pourquoi ces besoins et les seringues sont idéales.

Début d’euthanasier l’animal à l’aide de dioxyde de carbone. Suite à l’euthanasie, tenez le rongeur par la peau du cou avec le corps suspendu verticalement. Cette retenue est critique car le corps doit être tout droit pour éviter la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine. Notez que le cœur est situé approximativement au niveau du coude. Le côté d’insertion est dans l’encoche située juste à gauche de la xiphoïde, parallèle à la colonne vertébrale et sous les côtes.

Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, dans la poitrine et percer le cœur. Appliquer une légère contre-pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue. Attendez que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Environ la moitié du volume sanguin total peut être prélevée une souris ou un rat par ponction cardiaque. Cela équivaut à environ 1 mL de sang de souris moyenne d’environ 10 mL de sang chez un rat moyen

une autre position est le décubitus dorsal lorsque vous utilisez l’approche latérale. Dans ce cas, placez l’aiguille entre les nervures sur l’animal ' s côté gauche. Le point d’entrée est mesuré sur la pointe du coude sur la paroi thoracique. Insérer l’aiguille, biseau vers le haut, perpendiculaire au plan de la table à un point situé à mi-chemin sur la paroi thoracique. Appliquez une légère pression arrière avec la seringue. Si l’aiguille se trouve dans le sang du cœur s’écoule dans la seringue. Encore une fois, attendez jusqu'à ce que le sang a rempli le canon avant d’ajouter la contre-pression supplémentaire. Remarque que dans les deux positions, contre-pression excessive risque de s’effondrer au cœur obstruant le biseau de l’aiguille et l’arrêt de la circulation sanguine dans la seringue.

Une autre méthode pour recueillir le sang cardiaque est par l’intermédiaire de la veine cave caudale. Le matériel nécessaire pour cette procédure sont une seringue appropriée avec une aiguille de taille correcte, attachée ; ciseaux pour l’ouverture de la cavité abdominale, atraumatique petit pouce éponge de forceps et de gaze. Cette technique nécessite que l’animal être profondément anesthésiés und maintenue sous anesthésie tout au long de la procédure. Narcose de CO2 n’est pas une option, car le cœur animal doit se battre pour cette procédure. Mettre l’animal en position de décubitus dorsal et fixer les branches à la plate-forme. Il convient d’étendre les membres du corps.

Maintenant soulever la peau avec une pince et utiliser des ciseaux pour faire une petite coupe transversale à travers la peau juste au-dessus du bassin dans le prépuce chez les mâles ou de femelles. Ensuite, placez le point des ciseaux dans la coupe et faire une incision médiane à travers la peau dans le bassin ou le prépuce à la xiphoïde. Avec la peau reflétée latéralement, soulevez le muscle et faire une petite coupe transversale à travers le muscle, juste au-dessus de la coupe de la peau.

Placer le point du ciseaux dans l’abdomen et faire une incision médiane à travers le muscle à la xiphoïde. N’oubliez pas du point de ciseaux vers le haut pour éviter un quelconque des organes de coupe d’angle. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Veillez à ne pas perforer le foie. Déplacez doucement les intestins de l’animal ' s gauche pour exposer la veine cave postérieure. Placez une compresse sur le foie et reposer votre index et le majeur à ce sujet. Avec votre autre main, introduire l’aiguille, biseau vers le haut dans la veine cave, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et de la bifurcation iliaque. Retirer lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Eviter

mouvement de main, que pourrait causer la rupture du navire. Aussi, prélèvement de sang trop rapide peut provoquer le navire de s’effondrer sur le biseau obstruant la collecte de sang ouverture et prévention. Le principal avantage de cette technique est la capacité de recueillir un échantillon stérile parce que l’aiguille ne traverse pas la peau.

Enfin, laissez ' s coup d’oeil à certaines applications de ces techniques de retrait de sang. Immuno-oncologie est un domaine émergent, et chercheurs dans ce domaine souvent effectuent des prélèvements sanguins pour étudier les cellules immunitaires à différents stades de développement du cancer. Par exemple, ici des chercheurs ont recueilli sang cardiaque chez des souris porteuses du cancer à isoler et à quantifier les neutrophiles à dix, vingt et trente jours après la prise de greffe tumorale.

Sang d’autre part, la composition est également fréquemment étudiés par les physiologistes. Comme dans cette étude, chercheurs se sont intéressés à évaluer la fonction rénale chez les animaux diabétiques. Pour ce faire, ces scientifiques a tout d’abord injecté un colorant dans un modèle animal du diabète. Ensuite, ils ont ensuite utilisé queue snip méthode pour recueillir le sang à plusieurs points de temps pour évaluer la concentration de colorant dans le sang, qui a été finalement utilisée pour calculer le taux de filtration glomérulaire qui a mis en évidence la différence de la fonction rénale après diabète induction.

Enfin, cellules chercheurs utilisation des échantillons de sang pour évaluer la réussite de l’incorporation de cellules du donneur dans le destinataire de la tige ' système s. Ici, les enquêteurs ont transplanté tout d’abord des cellules de moelle osseuse de souris mâles dans un type sauvage et animal femelle génétiquement modifié via l’injection dans la veine queue. Ensuite, ils ont recueilli le sang le sinus rétro orbital de la souris destinataire afin d’étudier l’ADN génomique des cellules sanguines à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase. Cela a fourni le pourcentage de la prise de la greffe de cellules du donneur dans les deux types d’animaux.

vous ' ve juste regardé JoVE ' première tranche s sur les techniques de retrait de sang. S’il vous plaît voir la vidéo suivante dans la série d’examiner comment effectuer autres techniques couramment utilisés de collecte de sang chez les animaux de laboratoire. Comme toujours, Merci de regarder !

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