Retiro de la sangre II

Lab Animal Research

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Overview

Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en

la colección de la sangre de ratones y ratas para el análisis puede realizarse a través de una variedad de métodos. Cada método de colección tiene variaciones en el tipo de retención requerida, la invasividad del procedimiento y la necesidad de anestesia general. 1 Históricamente, el uso de la cavidad sinusal retro-orbitales se ha utilizado, pero no sin debate. La controversia relacionada con el potencial daño de tejido, o incluso ceguera, causada por hemorragias retro-orbital ha llevado al desarrollo de la vena facial y submaxilar sangrado métodos en ratones. Colección de la sangre de la vena safena en ratones y ratas es otra técnica que se ha desarrollado. Estos procedimientos no requieren anestesia y por lo tanto es convenientes el uso de anestésicos puede confundir los resultados de sangre u otros datos.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la investigación de animales de laboratorio. Retiro de la sangre II. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

hay una vena facial en el ratón que se extiende desde el plexo ocular por la mejilla y una vena submaxilar que corre a lo largo de la mandíbula inferior. Ambos vasos confluyen en la vena yugular justo debajo de la línea de la mandíbula, que sean fácilmente accesibles. Pueden tomar muestras de serie de cualquier recipiente alternando el lado utilizado. Sin embargo, ninguna de las partes utilizará más a menudo que cada 5-7 días. 2

precauciones deben tomarse al realizar un sangrado de la vena facial. Como el canal auditivo se encuentra situado cerca de la vena facial, si la extremidad de la lanceta se dirige caudalmente, el canal será traspasado. Esto resultará en un efecto de sifón, haciendo que la sangre de la oreja. A pesar de esto, todavía se puede recoger sangre, y el ratón no sufra ningún daño permanente. Sin embargo, esto puede causar el animal a su agitar la cabeza, salpicaduras de sangre en la jaula.

cuando una hemorragia de la vena submaxilar, la profundidad de inserción de la aguja es fundamental. Una profundidad de inserción superior a 4-5.5 mm puede causar trauma a los músculos, nervios y otros recipientes que están en la cabeza, cuello y cavidad bucal. Complicaciones posteriores incluyen hemorragia excesiva que resulta en hipovolemia, ahogamiento causado por el líquido en la boca y el daño a las estructuras orales que interfiere con comer y beber.

restricción del animal es fundamental para un exitoso sangrado de la vena facial y la vena submaxilar procedimientos. Si la empuñadura en el pescuezo está demasiado apretada, puede restringir el flujo sanguíneo hacia la vena facial. Esto resultará en una reducción en el volumen recogido. Volúmenes de la colección varían en la vena facial y la vena submaxilar sangrado. Es imprescindible para limitar los volúmenes de la colección para que no sobrepase el volumen máximo para recolección de sangre de supervivencia según las políticas institucionales y un protocolo de animales aprobado. Garantizar la hemostasia cuando se recoge la cantidad deseada evitará la pérdida de sangre adicional o excesiva. 2

colección de la sangre de la vena safena es otra alternativa viable para serie sangra. La vena safena lateral es un recipiente superficial que corre dorsalmente, y luego lateralmente, a través de la articulación tarsal. 3 Aunque este procedimiento puede ser estéticamente más aceptable que el sangrado retro orbitario, debido a la preparación necesaria- y uso de anestesia para este método es en realidad no puede ser más estresante para el animal. Las complicaciones que pueden surgir de una safena hemorragia están relacionados con el sitio de punción. Si la punción de la aguja no está directamente en el vaso, sangre piscina mayo subcutáneo, dando por resultado un hematoma. Hematomas, infección y favoreciendo de la extremidad son otros posibles problemas. Este método requiere entrenamiento, pero es fácilmente captado. Volúmenes recogidos con este método son entre 10-150 μL, dependiendo de la frecuencia de muestreo. 4 las muestras son variables en calidad ya que pueden contener productos de tejido. No más de cuatro muestras de sangre deben tomarse dentro de un período de 24 horas desde la misma Leg

la vena femoral es otra opción para recolección de sangre de una rata. La vena femoral corre en el aspecto medial de la pierna trasera desde la ingle a la rodilla antes de cruzar la rodilla y cada vez el lateral safeno, lo que es fácilmente accesible. Aunque este procedimiento puede realizarse sin el uso de un anestésico, requieren dos personas una persona tendrá la pierna en el punto donde la pierna y el abdomen se conectan para ocluir la vena, mientras que el otro realiza la venopunción y recoge la sangre.

la ventaja de utilizar la vena femoral es que un volumen más grande es más fácilmente de él que de la safena vena. Sin embargo, debido a la vena femoral es grande, es propensa a la formación del hematoma. Esto puede exacerbado por demasiado agarre en la pierna, que puede causar la contusión adicional. Con este método de colección de sangre, hay variación en la cantidad de sangre recogida por sangrado después del retiro de la aguja. Es imprescindible para asegurar la hemostasia para evitar esta pérdida de sangre excesiva.

Procedure

1. sangrado de la vena facial en ratones

  1. equipos
    1. colección de la sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es conveniente recoger la sangre directamente en tubos de hematocrito.
    2. Lancetas
    3. vara de oro se seleccionará en función del tamaño apropiado para el animal según edad y sexo.
      1. Lancetas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
        lancet 4 mm: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
        lancet 5 mm: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
        lancet 5 mm: ratones machos menores de 6 semanas (bajo ~ 20 gramos de peso corporal)
        lancet 5 mm: para solo soltar muestras (frotis)
        lancet 5,5 mm: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
        lanceta de 5.5 mm: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
        lancet 5,5 mm: muestras grandes < /li >
  2. Seguridad
    1. ratones están sujetos mediante la técnica de scruffing.
    2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la lanceta.
  3. Retirada de la sangre
    1. la lanceta de tamaño adecuado se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
    2. El punto de punción es ligeramente inclinado, con la punta hacia la nariz.
    3. La hoja lanceta se utiliza mejor en posición vertical.
    4. Mientras el ratón, localice el área aproximada de la vena facial por la medición de la longitud del ojo debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente.
    5. Con la punta de la lanceta, suavemente sentir el punto en que termina la jawbone.
    6. Para mejor precisión de puncionar el vaso, coloque el ratón en lateral recumbency.
    7. Perforar la piel en el hombro de la lanceta en ese momento. Esto se realiza con una presión firme y no como lanzando un dardo.
    8. Al retirar la lanceta, sangre comenzará a fluir.
    9. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
    10. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
    11. Borra la presión del sitio y liberación de punción en el pescuezo para hemostasia.

Figure 1
figura 1. Sangrado de la vena facial en los ratones.

2. Submandibular sangrar en los ratones: aunque muy similar a la técnica para el sangrado de la vena facial, hay variaciones en el equipo y las diferencias sutiles en este procedimiento sangrado.

  1. Equipos
    1. colección de la sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es conveniente recoger directamente en los tubos de hematocrito.
    2. 18-22 medidor de agujas se seleccionan según el tamaño adecuado para los animales según edad y sexo.
      1. Agujas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
        calibre 22: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
        calibre 20: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
        calibre 20: ratones machos menores de 6 semanas (debajo de ~ 20 gra MS de peso corporal)
        calibre 20: para colocar solo muestras (frotis)
        calibre 18: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
        calibre 18: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
        calibre 18: muestras grandes
    3. < /OL >
    4. seguridad
      1. ratones están sujetos mediante la técnica de scruffing.
      2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la aguja.
    5. Retirada de la sangre
      1. la aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
      2. Mientras el ratón, localizar la zona aproximada de la vena submaxilar por el punto donde una línea desde la esquina de la boca se cruza con una línea desde el ángulo lateral del ojo. Esto coincide con un hoyuelo pequeño, lampiño encontrado caudal a la esquina de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.
      3. Para mejor precisión de puncionar el vaso, coloque el ratón en lateral recumbency.
      4. Perforar la piel con la punta de la aguja en ese punto. Esto se realiza con una presión firme y no como lanzando un dardo.
      5. No se inserta la aguja más allá de la punta del bisel.
      6. Al retirar la aguja, sangre comenzará a fluir.
      7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
      8. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
      9. Borra el sitio de punción y liberar la presión en el pescuezo para hemostasia.

    Figure 2
    figura 2. Sangrado de la vena submaxilar en ratones.

    3. purga safena

    1. equipos
      1. claro conos de sujeción de plástico, flexible se pueden utilizar el ratón o la rata. Para los ratones, tubos cónicos plásticos modificados mililitro 50 pueden utilizarse para sujeción. Para las ratas, modificado tubos de sujeción de plexiglás-con una ranura de ancho suficiente para extender la pierna trasera-puede utilizarse.
      2. Cuando se utiliza el cono de plástico, se mide con la longitud del cuerpo del animal, y se corta un agujero oval a nivel del muslo.
      3. A tubo cónico puede modificarse para un ratón para este método de colección de sangre cortando el extremo del tubo para permitir que un agujero de respiración. Se corta una ranura desde el extremo de la tapa del tubo de 1/2 pulgada de ancho y 2 pulgadas de largo. Los bordes son cubiertos de cinta del paño o alisados para seguridad animal.
      4. A torniquete se fabrica utilizando una jeringa de cc de 3 y una longitud de sutura no absorbible 2-0. 3
      5. triple ungüento antibiótico o vaselina blanca se utiliza como una barrera a prueba de humedad en la piel.
      6. Aguja de calibre 22 A es el tamaño preferido para la venipunción.
      7. Se recoge sangre directamente en tubos de hematocrito.
    2. Seguridad
      1. conos de plástico Flexible
        1. el ratón o rata se coloca en el cono de nariz primero.
        2. El extremo del cono se dobla y cierra con una abrazadera pequeña carpeta los animales impidiendo el cono de sujeción.
        3. La pierna trasera se tira suavemente a través del oval abertura hasta la ingle.
      2. Tubo cónico para los ratones
        1. el ratón se coloca en el primer nariz de tubo.
        2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura de.
        3. El dedo medio se coloca sobre el extremo del tubo para evitar que el ratón sale del tubo de.
        4. El dedo índice y el pulgar estabilizan el ratón ' s Leg
      3. Tubo de sujeción de plexiglás para las ratas
        1. la rata se coloca en el primer nariz de tubo.
        2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura de.
        3. El extremo del tubo esté asegurado para evitar que la rata de copia de seguridad y salir el tubo de.
        4. El dedo índice y el pulgar estabilizan la rata ' s Leg
    3. Retirada de la sangre
      1. el pelo se quita de la cara lateral de la pata desde el corvejón a la Babilla. Esto puede hacerse por punteo, afeitarse o usar una crema depilatoria.
      2. Una vez que se ha eliminado el pelo, una pequeña cantidad de ungüento se aplica y se extendió en una capa muy delgada sobre la zona sin pelo.
      3. El torniquete se aplica hasta cranially posible y apretado.
      4. La nave safena corriendo por la superficie externa de la pierna desde la rodilla hasta el tobillo empieza a llenar y será elevada y fácil de visualizar.
      5. La aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel directamente sobre el vaso sanguíneo. Pinchar el vaso. Tenga cuidado de no insertar la aguja profundamente en la pierna, para evitar pinchar el músculo o hueso de golpear.
      6. La sangre se grano para arriba en la superficie de la pierna para la colección con el tubo de hematocrito.
      7. Una vez que se ha recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia.
      8. Una vez blha dejado de eeding, quitar el animal de la restricción y volver a la jaula casa.

    Figure 1
    figura 3. Sangrado de la vena safena en ratones.

    4. vena femoral para las ratas

    1. equipos
      1. sangre se recoge en un tubo de hematocrito.
      2. Ungüento antibiótico triple es necesario para crear una barrera entre el piel/del pelo y la gota de sangre.
      3. Aguja de calibre 22 A se utiliza para punzar la vena.
      4. Un cortapelos pequeño, portable con aproximadamente 1 " cuchilla ancha se utiliza para recortar el pelo de la Leg
    2. Seguridad
      1. ratas están sujetos mediante un cono de sujeción plástico transparente, flexible.
      2. El plástico conos se miden contra la longitud del cuerpo y un orificio oval a nivel del muslo. El cono se corta tales que la pierna trasera puede ser exteriorizada con acceso a la vena.
    3. Retirada de la sangre
      1. se rasura el pelo de la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla.
      2. Ungüento antibiótico triple se aplica en una capa delgada en el sitio de punción.
      3. La persona de alojamiento ocluye la vena y tiene la rata con la superficie interna de la pierna hacia el flebotomista.
      4. Usar la aguja para perforar la vena. La aguja se mantiene perpendicular a los vasos sanguíneos y la punción se realiza directamente en la vena.
      5. La puntura se hace como cerca de la rodilla como sea posible, permitiendo para el muestreo adicional anterior el primer sitio de colección de sangre.
      6. La nave es superficial. Por lo tanto, la profundidad de la punción no debe ser más profunda que la longitud del bisel de la aguja.
      7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque la rata con la pierna más baja que el corazón.
      8. Recoger la sangre en los tubos de hematocrito como granos en la superficie de la piel.
      9. Libere la presión en la pierna y aplique presión sobre el sitio de punción para conseguir la hemostasia.

    Figure 4
    figura 4. Sangrado de la vena femoral en ratas.

    recogiendo sangre de ratones y ratas es necesario para una gran variedad de estudios científicos y los investigadores han desarrollado diferentes métodos para lograr objetivos específicos experimentales.

    En la primera entrega, nos comentan la consideración de retirada de sangre general y revisado el sangrado retro orbital ojo, cola tijeras y nicks, así como métodos de recolección de sangre intra cardiaca. Aquí, se describen los procedimientos para recolección de sangre de las venas facial, submaxilares, safenas y femorales. Estos métodos son menos invasivos y no requieren anestesia, que es métodos de elección cuando el uso de anestésicos puede confundir los resultados de sangre u otros datos.

    vamos a comenzar con el procedimiento para la obtención de una muestra de sangre de una vena facial murina. En el ratón, hay una fácil acceso vena facial que se extiende por la mejilla. Empezar por elegir el equipo adecuado para el procedimiento. Básicamente, usted necesita un tubo de centrífuga pequeña para recolección de sangre y una lanceta, que está disponible en diferentes tamaños. Selección de lancet correcto es dependiente de la edad, sexo y peso corporal del animal y el tamaño de muestra a recoger. Ver protocolo de texto para más detalles sobre la selección de The lancet.

    Comenzar el procedimiento por el animal mediante la técnica de scruffing de restricción. Restricción adecuada minimiza el movimiento de lado a lado de la cabeza y ayuda a asegurar la venopunción precisa y segura con la lanceta. Si el agarre es demasiado apretado, el flujo de sangre puede restringir resultando en un menor volumen recogido. Una vez que el animal es inmovilizado, localice el área aproximada de la vena facial por la medición de la longitud del ojo debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente. Con la punta de la lanceta con cuidado siento por el punto en que termina la mandíbula. Para mejor precisión de puncionar el vaso, puede que desee posicionar el ratón en su lado.

    Ahora, en el sitio de inserción, sujete la lanceta perpendicular a la superficie de la piel con la punta mirando ligeramente hacia la nariz. Esto es fundamental, porque si la extremidad de la lanceta se dirige caudalmente, el canal auditivo se traspasaron lo que causa hemorragia del oído. Punción de la vena, aplique una presión firme y perforar la piel hasta el hombro lanceta. Al retirarla, la sangre comenzará a fluir. Para ayudar en el flujo, la posición del animal con la cabeza más baja que el corazón. Para detener el sangrado, secar el sitio de punción para conseguir la hemostasia y prevenir la pérdida de sangre excesiva. Por último, suelte la presión en el pescuezo y devolver el animal a su jaula. Tenga en cuenta que los volúmenes de la colección puede variar, pero es imprescindible no debe exceder el volumen máximo para recolección de sangre de supervivencia. Vea el protocolo de texto del sangre retirada un vídeo para obtener más información sobre volumen máximo recomendado de colección. Pueden tomar muestras de la serie alternando el lado utilizado. Ninguno de los dos debe utilizarse más a menudo que cada 5-7 días.

    ahora vamos a revisar el método de sangrado de la vena submaxilar. Aunque esto es muy similar a la técnica para el sangrado de la vena facial, hay variaciones en el equipo y sutiles diferencias en el procedimiento de purga.

    La vena submaxilar corre a lo largo de la mandíbula del ratón y converge con la vena facial en la vena yugular. En lugar de una lanceta, este método se realiza mediante agujas. Pero similar a lancetas, selección de aguja de calibre depende de la edad, sexo y tamaño de muestra y el peso del animal - ver protocolo de texto para detalles.

    Para iniciar, pescuezo del animal de la misma manera que el facial venas sangrar para que exista un mínimo movimiento de lado a lado de la cabeza. Recordar - agarre demasiado apretado puede disminuir el volumen de la colección de la sangre. Mientras el ratón, imagina una línea desde la esquina de la boca en toda la cara y una línea desde el ángulo lateral del ojo. El punto de intersección de estas líneas es el área aproximado de la vena submaxilar. Esto coincide con un pequeño hoyuelo sin pelo encontrado caudal a la esquina de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.

    Para mayor precisión, coloque el animal en recumbency lateral (3.6.1). A continuación, sujete la aguja perpendicular a la superficie de la piel e insértela con un firme empujón. No inserte la aguja más allá de la punta de bisel, como la profundidad de inserción mayor de lo puede provocar un trauma a los músculos, nervios y otros recipientes que están en la cabeza, cuello y cavidad bucal. Al retirar la aguja, la sangre comenzará a fluir. Como para el sangrado de la vena facial, Coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón para ayudar con el flujo de sangre. Por último, seque el sitio de punción para conseguir la hemostasia y librar la presión sobre el pescuezo a regresar el animal a su jaula.

    ahora, vamos a aprender a recoger la sangre de la vena safena. Esta vena es un vaso superficial que se extiende dorsal y lateralmente a través de la articulación tarsal.

    El equipo que usted necesita para este procedimiento incluye un dispositivo de restricción, que puede ser un plástico flexible una de ratas o ratones puede utilizarse un tubo cónico plástico modificado de 50 mililitros. Tenga en cuenta que el extremo del tubo se corta para permitir que un agujero de respiración, y se corta una ranura larga media pulgada de ancho y 2 pulgadas desde el extremo del casquillo. Los bordes están cubiertos de cinta del coágulo para la seguridad del animal. Este procedimiento también requiere un torniquete--fabricado usando una jeringa de cc de 3 y una longitud de 0-2 sutura no-absorbible, ungüento triple antibiótico con un hisopo, para ser utilizado como una barrera de prueba de humedad entre la piel y la gota de sangre, una recortadora de pelo, una 22 calibre aguja para venopunción y el tubo de hematocrito para recolección de sangre.

    Para frenar un ratón, colocar en el tubo, primero de la nariz. Entonces, suavemente la pata trasera de la guía en la ranura y estabilizar con el dedo índice y el pulgar. Posteriormente, afeita el pelo de la cara lateral de la pata desde el corvejón a la Babilla. A continuación, Unte una capa muy delgada de ungüento antibiótico triple a la zona sin pelo. A continuación, aplique el torniquete cranially tan lejos como sea posible y apretar. El buque safeno corriendo por la superficie externa de la rodilla hasta el tobillo empieza a llenar y será elevada y fácil de visualizar.

    a continuación, mantenga una aguja de calibre 22 directamente sobre los vasos sanguíneos y perpendicular a la superficie de la piel. Y perforar el recipiente, teniendo cuidado de no insertar la aguja demasiado profundo y penetrante del músculo o del hueso. La sangre se grano para arriba en la superficie de la pierna para la recogida en un tubo de hematocrito. Una vez que se ha recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia. Después de que el sangrado se ha detenido, quitar el animal de la restricción y volver a su jaula. Volúmenes recogidos con este método son entre 10 a 150 μ L, dependiendo de la frecuencia de muestreo. Y la calidad de la muestra es variable, ya que puede contener productos de tejido. No más de 4 muestras de sangre deben tomarse dentro de un período de 24 horas desde la misma Leg

    por último, aprenderemos a recoger la sangre de la vena femoral, que es otra opción para recolección de sangre de una rata. La vena femoral corre en el aspecto medial de la pierna trasera desde la ingle a la rodilla antes de cruzar la rodilla y convirtiéndose en la vena safena lateral, lo que es fácilmente accesible.

    La ventaja de sangrado de la vena femoral es que un volumen mayor se obtiene más fácilmente que de la vena safena. La desventaja es que este procedimiento, en un animal consciente, requiere de dos personas. El equipo necesario para este procedimiento son similares al método de la vena safena, excepto que no requiere el torniquete y el dispositivo que refrena preferible es un cono flexible. Para seleccionar el cono correcto, medir contra la longitud del cuerpo del animal y luego realizar un orificio oval corte a nivel del muslo.

    Para frenar al animal, lo coloca en el tubo, primero la nariz. Luego, doble el extremo del cono y cerrar con un broche aprietapapel pequeño impidiendo la salida de los animales. Ahora tire de la pierna trasera a través de la oval abertura para acceder a la vena femoral. No agarre demasiado ya que podría exacerbar la formación del hematoma. A continuación, afeitar la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla y aplique una capa delgada de ungüento antibiótico triple en la zona sin pelo. Posteriormente, la persona de alojamiento debe ocluir la vena femoral y agarrar la rata con la superficie interna de la pierna frente a la persona que va a extraer la sangre. La aguja de calibre 22 perpendicular a los vasos sanguíneos, directamente pinchar la vena y recoge la sangre en tubos hematocrito como granos en la superficie de la piel. La punción debe ser tan cerca de la rodilla como sea posible para permitir un muestreo futuro anterior a este sitio. Además, asegúrese de que la profundidad de la punción es no más profunda que la longitud del bisel de la aguja. Para ayudar el flujo sanguíneo, coloque la rata con la pierna más baja que el corazón. Finalmente, suelte la presión en la pierna y aplique presión sobre el sitio de punción para conseguir la hemostasia y prevenir la pérdida de sangre excesiva. Tenga en cuenta que significativamente más cantidad de sangre se puede recoger mediante este procedimiento.

    después de discutir los fundamentos de las técnicas de colección de sangre, vamos a repasar algunos ejemplos de por qué estos procedimientos pueden ser útiles para la investigación científica

    sangre es a menudo analizada para confirmar la inmune respuesta durante el desarrollo de una vacuna. Aquí, los investigadores entregaron una vacuna peptídica a animales que sufren de cáncer de vejiga. Después, recogieron la sangre vía la vena submaxilar y separó el suero para detectar los niveles de diversas citocinas, que sirven como indicadores de la eficacia de la vacuna.

    Colección de la sangre se realiza comúnmente para probar la eficacia de un tratamiento mediante el estudio de biomarcadores de la enfermedad humana, como los niveles de glucosa en la diabetes. Estos investigadores estaban interesados en las pruebas de la eficacia de una terapia de gene nuevo entregada vía la vena de la cola en los animales diabéticos. Después de la inyección, estos investigadores obtuvieron sangre de la vena safena en varios puntos del tiempo para analizar el efecto de diferentes protocolos de tratamiento en el nivel de glucosa en sangre.

    Por último, para algunos experimentos, es importante conocer la situación básica del animal, tales como los niveles de inflamación o de estrés. En este ejemplo, plasma de sangre se obtuvo de una rata antes y después de un evento estresante. Y como se puede ver, la corticosterona y la hormona del estrés, el nivel es mayor en animales diez minutos después del evento estresante.

    sólo ha visto segunda entrega de JoVE sobre técnicas de retirada de sangre para ratones y ratas. Después de ver tanto estos videos, debe tener una mejor comprensión de las consideraciones y procedimientos para recolección de sangre de estos animales y cómo se están utilizando en la investigación biomédica hoy. ¡Como siempre, gracias por ver!

    Summary

    el método de colección de la sangre puede causar una variación en el análisis de la muestra. El nivel de habilidad del técnico que realiza la recogida de la muestra tiene un impacto sobre la calidad de la muestra y el bienestar del animal. El uso de anestésicos también puede afectar la calidad de la muestra. Los métodos descritos aquí se realizan sin el uso de la anestesia, por lo tanto esa variable ha sido eliminada. También, todas estas técnicas pueden ser utilizados para el muestreo serial con mínimas molestias para el animal.

    References

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    3. Hem, A., Smith, A.J. and Solberg, P. 1998. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32. 364-368.
    4. Diehl, K-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R. Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J-M., and van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practical guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21. 15-23.

    1. sangrado de la vena facial en ratones

    1. equipos
      1. colección de la sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es conveniente recoger la sangre directamente en tubos de hematocrito.
      2. Lancetas
      3. vara de oro se seleccionará en función del tamaño apropiado para el animal según edad y sexo.
        1. Lancetas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
          lancet 4 mm: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
          lancet 5 mm: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
          lancet 5 mm: ratones machos menores de 6 semanas (bajo ~ 20 gramos de peso corporal)
          lancet 5 mm: para solo soltar muestras (frotis)
          lancet 5,5 mm: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
          lanceta de 5.5 mm: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
          lancet 5,5 mm: muestras grandes < /li >
    2. Seguridad
      1. ratones están sujetos mediante la técnica de scruffing.
      2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la lanceta.
    3. Retirada de la sangre
      1. la lanceta de tamaño adecuado se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
      2. El punto de punción es ligeramente inclinado, con la punta hacia la nariz.
      3. La hoja lanceta se utiliza mejor en posición vertical.
      4. Mientras el ratón, localice el área aproximada de la vena facial por la medición de la longitud del ojo debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente.
      5. Con la punta de la lanceta, suavemente sentir el punto en que termina la jawbone.
      6. Para mejor precisión de puncionar el vaso, coloque el ratón en lateral recumbency.
      7. Perforar la piel en el hombro de la lanceta en ese momento. Esto se realiza con una presión firme y no como lanzando un dardo.
      8. Al retirar la lanceta, sangre comenzará a fluir.
      9. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
      10. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
      11. Borra la presión del sitio y liberación de punción en el pescuezo para hemostasia.

    Figure 1
    figura 1. Sangrado de la vena facial en los ratones.

    2. Submandibular sangrar en los ratones: aunque muy similar a la técnica para el sangrado de la vena facial, hay variaciones en el equipo y las diferencias sutiles en este procedimiento sangrado.

    1. Equipos
      1. colección de la sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es conveniente recoger directamente en los tubos de hematocrito.
      2. 18-22 medidor de agujas se seleccionan según el tamaño adecuado para los animales según edad y sexo.
        1. Agujas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
          calibre 22: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
          calibre 20: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
          calibre 20: ratones machos menores de 6 semanas (debajo de ~ 20 gra MS de peso corporal)
          calibre 20: para colocar solo muestras (frotis)
          calibre 18: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
          calibre 18: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
          calibre 18: muestras grandes
      3. < /OL >
      4. seguridad
        1. ratones están sujetos mediante la técnica de scruffing.
        2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la aguja.
      5. Retirada de la sangre
        1. la aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
        2. Mientras el ratón, localizar la zona aproximada de la vena submaxilar por el punto donde una línea desde la esquina de la boca se cruza con una línea desde el ángulo lateral del ojo. Esto coincide con un hoyuelo pequeño, lampiño encontrado caudal a la esquina de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.
        3. Para mejor precisión de puncionar el vaso, coloque el ratón en lateral recumbency.
        4. Perforar la piel con la punta de la aguja en ese punto. Esto se realiza con una presión firme y no como lanzando un dardo.
        5. No se inserta la aguja más allá de la punta del bisel.
        6. Al retirar la aguja, sangre comenzará a fluir.
        7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
        8. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
        9. Borra el sitio de punción y liberar la presión en el pescuezo para hemostasia.

      Figure 2
      figura 2. Sangrado de la vena submaxilar en ratones.

      3. purga safena

      1. equipos
        1. claro conos de sujeción de plástico, flexible se pueden utilizar el ratón o la rata. Para los ratones, tubos cónicos plásticos modificados mililitro 50 pueden utilizarse para sujeción. Para las ratas, modificado tubos de sujeción de plexiglás-con una ranura de ancho suficiente para extender la pierna trasera-puede utilizarse.
        2. Cuando se utiliza el cono de plástico, se mide con la longitud del cuerpo del animal, y se corta un agujero oval a nivel del muslo.
        3. A tubo cónico puede modificarse para un ratón para este método de colección de sangre cortando el extremo del tubo para permitir que un agujero de respiración. Se corta una ranura desde el extremo de la tapa del tubo de 1/2 pulgada de ancho y 2 pulgadas de largo. Los bordes son cubiertos de cinta del paño o alisados para seguridad animal.
        4. A torniquete se fabrica utilizando una jeringa de cc de 3 y una longitud de sutura no absorbible 2-0. 3
        5. triple ungüento antibiótico o vaselina blanca se utiliza como una barrera a prueba de humedad en la piel.
        6. Aguja de calibre 22 A es el tamaño preferido para la venipunción.
        7. Se recoge sangre directamente en tubos de hematocrito.
      2. Seguridad
        1. conos de plástico Flexible
          1. el ratón o rata se coloca en el cono de nariz primero.
          2. El extremo del cono se dobla y cierra con una abrazadera pequeña carpeta los animales impidiendo el cono de sujeción.
          3. La pierna trasera se tira suavemente a través del oval abertura hasta la ingle.
        2. Tubo cónico para los ratones
          1. el ratón se coloca en el primer nariz de tubo.
          2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura de.
          3. El dedo medio se coloca sobre el extremo del tubo para evitar que el ratón sale del tubo de.
          4. El dedo índice y el pulgar estabilizan el ratón ' s Leg
        3. Tubo de sujeción de plexiglás para las ratas
          1. la rata se coloca en el primer nariz de tubo.
          2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura de.
          3. El extremo del tubo esté asegurado para evitar que la rata de copia de seguridad y salir el tubo de.
          4. El dedo índice y el pulgar estabilizan la rata ' s Leg
      3. Retirada de la sangre
        1. el pelo se quita de la cara lateral de la pata desde el corvejón a la Babilla. Esto puede hacerse por punteo, afeitarse o usar una crema depilatoria.
        2. Una vez que se ha eliminado el pelo, una pequeña cantidad de ungüento se aplica y se extendió en una capa muy delgada sobre la zona sin pelo.
        3. El torniquete se aplica hasta cranially posible y apretado.
        4. La nave safena corriendo por la superficie externa de la pierna desde la rodilla hasta el tobillo empieza a llenar y será elevada y fácil de visualizar.
        5. La aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel directamente sobre el vaso sanguíneo. Pinchar el vaso. Tenga cuidado de no insertar la aguja profundamente en la pierna, para evitar pinchar el músculo o hueso de golpear.
        6. La sangre se grano para arriba en la superficie de la pierna para la colección con el tubo de hematocrito.
        7. Una vez que se ha recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia.
        8. Una vez blha dejado de eeding, quitar el animal de la restricción y volver a la jaula casa.

      Figure 1
      figura 3. Sangrado de la vena safena en ratones.

      4. vena femoral para las ratas

      1. equipos
        1. sangre se recoge en un tubo de hematocrito.
        2. Ungüento antibiótico triple es necesario para crear una barrera entre el piel/del pelo y la gota de sangre.
        3. Aguja de calibre 22 A se utiliza para punzar la vena.
        4. Un cortapelos pequeño, portable con aproximadamente 1 " cuchilla ancha se utiliza para recortar el pelo de la Leg
      2. Seguridad
        1. ratas están sujetos mediante un cono de sujeción plástico transparente, flexible.
        2. El plástico conos se miden contra la longitud del cuerpo y un orificio oval a nivel del muslo. El cono se corta tales que la pierna trasera puede ser exteriorizada con acceso a la vena.
      3. Retirada de la sangre
        1. se rasura el pelo de la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla.
        2. Ungüento antibiótico triple se aplica en una capa delgada en el sitio de punción.
        3. La persona de alojamiento ocluye la vena y tiene la rata con la superficie interna de la pierna hacia el flebotomista.
        4. Usar la aguja para perforar la vena. La aguja se mantiene perpendicular a los vasos sanguíneos y la punción se realiza directamente en la vena.
        5. La puntura se hace como cerca de la rodilla como sea posible, permitiendo para el muestreo adicional anterior el primer sitio de colección de sangre.
        6. La nave es superficial. Por lo tanto, la profundidad de la punción no debe ser más profunda que la longitud del bisel de la aguja.
        7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque la rata con la pierna más baja que el corazón.
        8. Recoger la sangre en los tubos de hematocrito como granos en la superficie de la piel.
        9. Libere la presión en la pierna y aplique presión sobre el sitio de punción para conseguir la hemostasia.

      Figure 4
      figura 4. Sangrado de la vena femoral en ratas.

      recogiendo sangre de ratones y ratas es necesario para una gran variedad de estudios científicos y los investigadores han desarrollado diferentes métodos para lograr objetivos específicos experimentales.

      En la primera entrega, nos comentan la consideración de retirada de sangre general y revisado el sangrado retro orbital ojo, cola tijeras y nicks, así como métodos de recolección de sangre intra cardiaca. Aquí, se describen los procedimientos para recolección de sangre de las venas facial, submaxilares, safenas y femorales. Estos métodos son menos invasivos y no requieren anestesia, que es métodos de elección cuando el uso de anestésicos puede confundir los resultados de sangre u otros datos.

      vamos a comenzar con el procedimiento para la obtención de una muestra de sangre de una vena facial murina. En el ratón, hay una fácil acceso vena facial que se extiende por la mejilla. Empezar por elegir el equipo adecuado para el procedimiento. Básicamente, usted necesita un tubo de centrífuga pequeña para recolección de sangre y una lanceta, que está disponible en diferentes tamaños. Selección de lancet correcto es dependiente de la edad, sexo y peso corporal del animal y el tamaño de muestra a recoger. Ver protocolo de texto para más detalles sobre la selección de The lancet.

      Comenzar el procedimiento por el animal mediante la técnica de scruffing de restricción. Restricción adecuada minimiza el movimiento de lado a lado de la cabeza y ayuda a asegurar la venopunción precisa y segura con la lanceta. Si el agarre es demasiado apretado, el flujo de sangre puede restringir resultando en un menor volumen recogido. Una vez que el animal es inmovilizado, localice el área aproximada de la vena facial por la medición de la longitud del ojo debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente. Con la punta de la lanceta con cuidado siento por el punto en que termina la mandíbula. Para mejor precisión de puncionar el vaso, puede que desee posicionar el ratón en su lado.

      Ahora, en el sitio de inserción, sujete la lanceta perpendicular a la superficie de la piel con la punta mirando ligeramente hacia la nariz. Esto es fundamental, porque si la extremidad de la lanceta se dirige caudalmente, el canal auditivo se traspasaron lo que causa hemorragia del oído. Punción de la vena, aplique una presión firme y perforar la piel hasta el hombro lanceta. Al retirarla, la sangre comenzará a fluir. Para ayudar en el flujo, la posición del animal con la cabeza más baja que el corazón. Para detener el sangrado, secar el sitio de punción para conseguir la hemostasia y prevenir la pérdida de sangre excesiva. Por último, suelte la presión en el pescuezo y devolver el animal a su jaula. Tenga en cuenta que los volúmenes de la colección puede variar, pero es imprescindible no debe exceder el volumen máximo para recolección de sangre de supervivencia. Vea el protocolo de texto del sangre retirada un vídeo para obtener más información sobre volumen máximo recomendado de colección. Pueden tomar muestras de la serie alternando el lado utilizado. Ninguno de los dos debe utilizarse más a menudo que cada 5-7 días.

      ahora vamos a revisar el método de sangrado de la vena submaxilar. Aunque esto es muy similar a la técnica para el sangrado de la vena facial, hay variaciones en el equipo y sutiles diferencias en el procedimiento de purga.

      La vena submaxilar corre a lo largo de la mandíbula del ratón y converge con la vena facial en la vena yugular. En lugar de una lanceta, este método se realiza mediante agujas. Pero similar a lancetas, selección de aguja de calibre depende de la edad, sexo y tamaño de muestra y el peso del animal - ver protocolo de texto para detalles.

      Para iniciar, pescuezo del animal de la misma manera que el facial venas sangrar para que exista un mínimo movimiento de lado a lado de la cabeza. Recordar - agarre demasiado apretado puede disminuir el volumen de la colección de la sangre. Mientras el ratón, imagina una línea desde la esquina de la boca en toda la cara y una línea desde el ángulo lateral del ojo. El punto de intersección de estas líneas es el área aproximado de la vena submaxilar. Esto coincide con un pequeño hoyuelo sin pelo encontrado caudal a la esquina de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.

      Para mayor precisión, coloque el animal en recumbency lateral (3.6.1). A continuación, sujete la aguja perpendicular a la superficie de la piel e insértela con un firme empujón. No inserte la aguja más allá de la punta de bisel, como la profundidad de inserción mayor de lo puede provocar un trauma a los músculos, nervios y otros recipientes que están en la cabeza, cuello y cavidad bucal. Al retirar la aguja, la sangre comenzará a fluir. Como para el sangrado de la vena facial, Coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón para ayudar con el flujo de sangre. Por último, seque el sitio de punción para conseguir la hemostasia y librar la presión sobre el pescuezo a regresar el animal a su jaula.

      ahora, vamos a aprender a recoger la sangre de la vena safena. Esta vena es un vaso superficial que se extiende dorsal y lateralmente a través de la articulación tarsal.

      El equipo que usted necesita para este procedimiento incluye un dispositivo de restricción, que puede ser un plástico flexible una de ratas o ratones puede utilizarse un tubo cónico plástico modificado de 50 mililitros. Tenga en cuenta que el extremo del tubo se corta para permitir que un agujero de respiración, y se corta una ranura larga media pulgada de ancho y 2 pulgadas desde el extremo del casquillo. Los bordes están cubiertos de cinta del coágulo para la seguridad del animal. Este procedimiento también requiere un torniquete--fabricado usando una jeringa de cc de 3 y una longitud de 0-2 sutura no-absorbible, ungüento triple antibiótico con un hisopo, para ser utilizado como una barrera de prueba de humedad entre la piel y la gota de sangre, una recortadora de pelo, una 22 calibre aguja para venopunción y el tubo de hematocrito para recolección de sangre.

      Para frenar un ratón, colocar en el tubo, primero de la nariz. Entonces, suavemente la pata trasera de la guía en la ranura y estabilizar con el dedo índice y el pulgar. Posteriormente, afeita el pelo de la cara lateral de la pata desde el corvejón a la Babilla. A continuación, Unte una capa muy delgada de ungüento antibiótico triple a la zona sin pelo. A continuación, aplique el torniquete cranially tan lejos como sea posible y apretar. El buque safeno corriendo por la superficie externa de la rodilla hasta el tobillo empieza a llenar y será elevada y fácil de visualizar.

      a continuación, mantenga una aguja de calibre 22 directamente sobre los vasos sanguíneos y perpendicular a la superficie de la piel. Y perforar el recipiente, teniendo cuidado de no insertar la aguja demasiado profundo y penetrante del músculo o del hueso. La sangre se grano para arriba en la superficie de la pierna para la recogida en un tubo de hematocrito. Una vez que se ha recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia. Después de que el sangrado se ha detenido, quitar el animal de la restricción y volver a su jaula. Volúmenes recogidos con este método son entre 10 a 150 μ L, dependiendo de la frecuencia de muestreo. Y la calidad de la muestra es variable, ya que puede contener productos de tejido. No más de 4 muestras de sangre deben tomarse dentro de un período de 24 horas desde la misma Leg

      por último, aprenderemos a recoger la sangre de la vena femoral, que es otra opción para recolección de sangre de una rata. La vena femoral corre en el aspecto medial de la pierna trasera desde la ingle a la rodilla antes de cruzar la rodilla y convirtiéndose en la vena safena lateral, lo que es fácilmente accesible.

      La ventaja de sangrado de la vena femoral es que un volumen mayor se obtiene más fácilmente que de la vena safena. La desventaja es que este procedimiento, en un animal consciente, requiere de dos personas. El equipo necesario para este procedimiento son similares al método de la vena safena, excepto que no requiere el torniquete y el dispositivo que refrena preferible es un cono flexible. Para seleccionar el cono correcto, medir contra la longitud del cuerpo del animal y luego realizar un orificio oval corte a nivel del muslo.

      Para frenar al animal, lo coloca en el tubo, primero la nariz. Luego, doble el extremo del cono y cerrar con un broche aprietapapel pequeño impidiendo la salida de los animales. Ahora tire de la pierna trasera a través de la oval abertura para acceder a la vena femoral. No agarre demasiado ya que podría exacerbar la formación del hematoma. A continuación, afeitar la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla y aplique una capa delgada de ungüento antibiótico triple en la zona sin pelo. Posteriormente, la persona de alojamiento debe ocluir la vena femoral y agarrar la rata con la superficie interna de la pierna frente a la persona que va a extraer la sangre. La aguja de calibre 22 perpendicular a los vasos sanguíneos, directamente pinchar la vena y recoge la sangre en tubos hematocrito como granos en la superficie de la piel. La punción debe ser tan cerca de la rodilla como sea posible para permitir un muestreo futuro anterior a este sitio. Además, asegúrese de que la profundidad de la punción es no más profunda que la longitud del bisel de la aguja. Para ayudar el flujo sanguíneo, coloque la rata con la pierna más baja que el corazón. Finalmente, suelte la presión en la pierna y aplique presión sobre el sitio de punción para conseguir la hemostasia y prevenir la pérdida de sangre excesiva. Tenga en cuenta que significativamente más cantidad de sangre se puede recoger mediante este procedimiento.

      después de discutir los fundamentos de las técnicas de colección de sangre, vamos a repasar algunos ejemplos de por qué estos procedimientos pueden ser útiles para la investigación científica

      sangre es a menudo analizada para confirmar la inmune respuesta durante el desarrollo de una vacuna. Aquí, los investigadores entregaron una vacuna peptídica a animales que sufren de cáncer de vejiga. Después, recogieron la sangre vía la vena submaxilar y separó el suero para detectar los niveles de diversas citocinas, que sirven como indicadores de la eficacia de la vacuna.

      Colección de la sangre se realiza comúnmente para probar la eficacia de un tratamiento mediante el estudio de biomarcadores de la enfermedad humana, como los niveles de glucosa en la diabetes. Estos investigadores estaban interesados en las pruebas de la eficacia de una terapia de gene nuevo entregada vía la vena de la cola en los animales diabéticos. Después de la inyección, estos investigadores obtuvieron sangre de la vena safena en varios puntos del tiempo para analizar el efecto de diferentes protocolos de tratamiento en el nivel de glucosa en sangre.

      Por último, para algunos experimentos, es importante conocer la situación básica del animal, tales como los niveles de inflamación o de estrés. En este ejemplo, plasma de sangre se obtuvo de una rata antes y después de un evento estresante. Y como se puede ver, la corticosterona y la hormona del estrés, el nivel es mayor en animales diez minutos después del evento estresante.

      sólo ha visto segunda entrega de JoVE sobre técnicas de retirada de sangre para ratones y ratas. Después de ver tanto estos videos, debe tener una mejor comprensión de las consideraciones y procedimientos para recolección de sangre de estos animales y cómo se están utilizando en la investigación biomédica hoy. ¡Como siempre, gracias por ver!

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