Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung von Abdominalaortenaneurysmen

Biomedical Engineering

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Overview

Quelle: Arvin H. Soepriatna1, Kelsey A. Bullens2, und Craig J. Goergen1

1 Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana

2 Institut für Biochemie, Purdue University, West Lafayette, Indiana

Die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung (NIRF) ist eine aufregende optische Technik, bei der fluoreszierende Sonden komplexe biomolekulare Baugruppen in Geweben visualisiert werden. NIRF-Bildgebung hat gegenüber herkömmlichen bildgebenden Verfahren zur nichtinvasiven Bildgebung von Krankheiten viele Vorteile. Im Gegensatz zur Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Positronen-Emissionstomographie (PET) ist die NIRF-Bildgebung schnell, mit hohem Durchsatz und beinhaltet keine ionisierende Strahlung. Darüber hinaus bieten die jüngsten Entwicklungen in der Entwicklung zielspezifischer und aktivierbarer Fluoreszenzsonden NIRF eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit und machen es zu einer attraktiven Modalität bei der Untersuchung von Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das vorgestellte Verfahren soll die Prinzipien der NIRF-Bildgebung aufzeigen und zeigen, wie in vivo- und ex vivo-Experimente an Kleintieren durchgeführt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu untersuchen. Das hier gezeigte spezifische Beispiel verwendet eine aktivierbare fluoreszierende Sonde für Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP2), um seine Aufnahme in zwei verschiedenen Nagetiermodellen von Abdominalaortenaneurysmen (AAAs) zu untersuchen.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Biomedizinische Technik. Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung von Abdominalaortenaneurysmen. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

Wie der Name schon sagt, nutzt die NIRF-Bildgebung Licht im ersten Nahinfrarotfenster, das von 650 nm bis 900 nm reicht, um Photonen in gewebe zu liefern. Die Energie, E, eines Photons ist durch Gleichung 1 gekennzeichnet, wobei h die Planck-Konstante ist, c die Lichtgeschwindigkeit in einem Vakuum und die Wellenlänge des Lichts.

Equation 1= Equation 2 (Gleichung 1)

Zielspezifische fluoreszierende Moleküle, sogenannte Fluorophore, werden in der Regel durch Gentechnik oder durch Schwanzveneninjektion vor der Bildgebung in das Tier eingeführt. Diese Fluorophore absorbieren Photonenenergie, die die Energie der Moleküle aus dem Bodenzustand, S0,in den instabilen, angeregten Zustand S1' erhebt. Aufgrund der Instabilität desS 1'-Zustands entspannen sich die Moleküle auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau innerhalb dieses Zustands und geben Energie in Form von Wärme frei. Die Fluorophore, jetzt im entspannten, aufgeregten Zustand S1, kehren dann in den Bodenzustand S0zurück und emittieren Licht bei einer bestimmten Wellenlänge. Das emittierte Licht, das aufgrund der Energieableitung in Form von Wärme eine längere Wellenlänge hat, wird dann mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem erfasst und aufgezeichnet. Die grundlegende Verschiebung zwischen Absorptions- und Emissionsspektren wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet und ist wichtig, da sie es ermöglicht, zwischen Anregung und Emissionslicht zu unterscheiden.

Procedure

Das folgende Verfahren enthält detaillierte Schritte, die erforderlich sind, um in vivo- und ex vivo NIRF-Bilder von Kleintieren zu sammeln:

1. Experimentelle Einrichtung

  1. Verbinden Sie eine Lichtwellenleiter mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem über eine Lichtleiter.
  2. Wählen Sie den entsprechenden Anregungsfilter für das Experiment aus. Der Anregungsfilter bestimmt die Wellenlänge des Lichts, das an die Probe geliefert werden soll, und sollte so gewählt werden, dass es dem Anregungsspektrum des in die Probe eingeführten Fluorophors entspricht.
  3. Wählen Sie den entsprechenden Emissionsfilter aus. Der Emissionsfilter blockiert unerwünschte Spektralkomponenten, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können, und sollte so gewählt werden, dass sie dem Emissionsspektrum des Fluorophors entspricht.

2. Probenvorbereitung

  1. In Vivo
    1. Anästhetisieren Sie das Tier in einer Induktionskammer mit Isofluran in einer Konzentration von 3-4% auf dem Durchflussmesserzifferblatt.
    2. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf dem Bildgebungsstadium fixiert ist, und halten Sie Isofluran in einer Konzentration von 1-2%. Eine Wärmequelle ist nicht notwendig, da die Tiere in der Regel nur für einen kurzen Zeitraum abgebildet werden (> 5 min), und ihre Körpertemperatur nicht wesentlich abnimmt.
    3. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Entfernen Sie das Haar aus dem Bereich des Interesses, indem Sie eine Enthaarungscreme auftragen.
    4. Enthaarungscreme auf den kleinsten Bedarf auftragen. Nach 30 s mit einem Gazepad abwischen. Wischen Sie den Bereich ein zweites Mal mit einem Ethylalkohol befeuchteten Gazepad, um die Enthaarungscreme vollständig zu entfernen.
    5. Ophthalmologische Salbe auf die Augen auftragen, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.
    6. Injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Für diese spezifische Anwendung wurden MMP2-aktivierbare Sonden intravenös in die Schwanzvene injiziert. An diesem Punkt kann die Maus abgebildet werden. Fahren Sie mit dem "Image Acquistion" dieses Protokolls fort, um fortzufahren. Überwachen Sie das Tier während des kurzen Eingriffs auf regelmäßige atmungsaktive s.
  2. Ex Vivo
    1. Nach der Injektion der Fluoreszenzsonde, euthanisieren Sie das Tier auf humane Weise nach den AVMA-Richtlinien von 2013 für die Euthaniasie von Tieren. Die Überdosierung von Kohlendioxid(CO2) ist eine gängige Praxis für die Einschläferne von Kleintieren.
    2. Chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse und sorgfältig entfernen überschüssiges Fettgewebe mit Zange.
    3. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen und legen Sie die Probe direkt auf der bildgebenden Bühne.

3. Bildaufnahme

  1. Öffnen Sie die molekulare Bildgebungssoftware und schalten Sie sowohl die Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.
  2. Öffnen Sie das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören: Standardbelichtung zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Time Lapse Exposure zur Erfassung einer Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall und Progressive Belichtung zur Erfassung einer kontinuierlichen Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten.
  3. Wählen Sie UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle.
  4. Passen Sie mithilfe des in der Vorschau angezeigten Bildes als Referenz den Fokus der Linse, das Sichtfeld und die Blende in der Aufnahmesystemkammer an, um die abgetastete Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe an.
  5. Schließen Sie das Vorschaufenster, und stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen.
  6. Klicken Sie auf 'Expose', um das Bild zu erfassen und zu speichern.
  7. Standard-Software für molekulare Bildgebung bietet in der Regel eine Vielzahl von Analyse-, Mess- und Bildkorrekturwerkzeugen, um Fluoreszenzsignale für die Bildanalyse zu quantifizieren.
  8. Entfernen Sie am Ende der Bildgebungssitzung die Probe/das Tier, schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsphase, um Schäden am System zu minimieren.

Die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung ist eine optische Technik, bei der fluoreszierende Sonden komplexe biomolekulare Baugruppen in Geweben visualisiert werden. Diese nichtinvasive bildgebende Technik, die auch als NIRF bekannt ist, ist schnell und erfordert keine ionisierende Strahlung.

In NIRF können fluoreszierende Sonden mit kleinen Molekülen konjugiert werden, um krebs- und herzkargherzische Erkrankungen zu untersuchen. Sie werden durch Nahinfrarotlicht angeregt, das tief in das Gewebe eindringt und verwendet werden kann, um gesundes Gewebe aus krankem Gewebe abzuleiten, das die Konzentration dieser Zielmoleküle verändert.

Dieses Video wird die Prinzipien der Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung sowie die Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-Experimenten bei Kleintieren zur Untersuchung einer Vielzahl von Krankheiten veranschaulichen.

Wie der Name schon sagt, nutzt die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung Licht innerhalb des ersten Nahinfrarotfensters, das von 650 Nanometern bis 900 Nanometer reicht, um Photonen in das Gewebe zu liefern. Zielspezifische fluoreszierende Moleküle, sogenannte Fluorophore, werden in der Regel durch Gentechnik oder Injektion vor der Bildgebung in ein Tier eingeführt.

Diese Fluorophore absorbieren Photonenenergie, die die Energie der Moleküle vom Bodenzustand S0 in den instabilen angeregten Zustand S1 prime hebt. Da dieser Zustand instabil ist, werden sich die Moleküle auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau innerhalb des angeregten Zustands entspannen und ihre Energie in Form von Wärme freisetzen. Die Fluorophore, die sich nun im entspannten aufgeregten Zustand S1 befinden, kehren dann in den Bodenzustand zurück und emittieren Licht einer bestimmten Wellenlänge.

Dieses Licht hat eine längere Wellenlänge als das Licht, das ursprünglich in das Fluorophor eingeführt wurde, aufgrund der Energie, die sich in Form von Wärme ableitet, während sich das Molekül auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau entspannt. Das emittierte Licht wird dann mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem erfasst und aufgezeichnet.

Ein Diagramm der Absorptions- und Emissionsspektren für das Fluorophor zeigt den Wellenlängenbereich, den das Fluorophor aufnehmen und emittieren kann. Diese grundlegende Verschiebung, die den Unterschied in Nanometern zwischen der Spitzenabsorption und den Spitzenemissionswellenlängen darstellt, wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Jedes Fluorophor verfügt über eine eigene Stokes-Verschiebung, die es ermöglicht, das Emissionslicht vom spannenden Licht zu unterscheiden und bildgebende Verfahren wie NIRF zu ermöglichen.

Nachdem wir die wichtigsten Prinzipien der Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung überprüft haben, gehen wir nun durch das Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ein Tier vorzubereiten und abzubilden.

Verwenden Sie zunächst eine faseroptische Lichtführung, um eine lichtoptische Lichtquelle mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem zu verbinden. Wählen Sie den Anregungsfilter aus, der dem Anregungsspektrum der fluoreszenz entspricht, die in die Probe eingeführt werden soll, um sicherzustellen, dass die richtige Wellenlänge des Lichts geliefert wird.

Wählen Sie als Nächstes den geeigneten Emissionsfilter aus, um dem Emissionsspektrum des Fluorophors zu entsprechen, der unerwünschte Spektralkomponenten blockiert, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können.

Um mit der Vorbereitung auf die In-vivo-Bildgebung zu beginnen, verwenden Sie Isofluran, um das Tier in einer Knockdown-Kammer zu beanten. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf der Bildstufe fixiert ist. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um das Haar aus dem Interessenbereich zu entfernen. Dann tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.

Anschließend injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, öffnen Sie die Software für molekulare Bildgebung. Schalten Sie sowohl die faseroptische Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.

Öffnen Sie anschließend das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören standardexposure zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Zeitrafferbelichtung, um eine Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall zu erfassen, und progressive Belichtung, um eine kontinuierliche Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten zu erfassen.

Wählen Sie dann UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle aus. Passen Sie mithilfe des Vorschaubilds als Referenz den Fokus, das Sichtfeld und den F-Stopp in der Erfassungssystemkammer an, um die bildbestückte Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe nach Bedarf an. Schließen Sie anschließend das Vorschaufenster. Stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen. Klicken Sie auf "Expose", um das Bild zu erfassen und zu speichern.

Um sich auf die Ex-vivo-Bildgebung vorzubereiten, müssen Sie das Tier nach der Injektion der Fluoreszenzsonde human einschläfern. Mit Zangen, entfernen Sie sorgfältig überschüssiges periaortisches Fett. Als nächstes, chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen. Platzieren Sie die Probe dann direkt auf der Bildstufe.

Stellen Sie das Ex-vivo-Gewebe nach dem gleichen Protokoll ab, wie es für die In-vivo-Bildgebung beschrieben wurde. Wenn sie abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe von der Bühne. Schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsstufe.

Nachdem wir nun das Protokoll zum Abrufen von Nahinfrarot-Feldbildern abgeschlossen haben, sollten wir die Ergebnisse dieser Scans überprüfen.

In diesen repräsentativen Bildern wird eine aktivierbare Fluoreszenzsonde systemisch über die Schwanzvene injiziert, um die Matrix Metalloproteinase oder MMP2 zu visualisieren. Hier sehen wir ein in vivo NIRF-Bild einer apolipoprotein-E-Mangelmaus, die nach der Infusion von Angiotensin II ein abdominales Aortenaneurysm entwickelte. Während die meisten der kleinen hohen Signalflecken aus der Hautautofluoreszenz stammen, präsentiert sich die Vaskulatur visuell als röhrenförmige Strukturen mit hohen fluoreszierenden Signalen.

Das zweite repräsentative Bild vergleicht NIRF-Bilder von abdominalen Aortenaneurysmen aus zwei verschiedenen Tiermodellen. Eines, ein suprarenales abdominales Aortenaneurysm in einer Angiotensin II-infundierten Apolipoprotein-E-Mangelmaus. Und zweitens ein infrarotes Bauchaortenaneurysm bei einer Ratte, die mit schweinepankreasischer Elastase infundiert ist.

In jedem sehen wir eine Zunahme der MMP2-Aktivität in der aneurysmalen Region der Bauchaorta. Überschüssige Fluoreszenzsonden werden gefiltert und in den Nieren angesammelt, was die dort beobachteten hellen Fluoreszenzsignale erklärt.

Betrachten wir nun einige andere Anwendungen der Nahinfrarot-Feldbildgebung. Erstens kann DIE NIRF-Bildgebung verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Erkrankungen in murinen Modellen zu untersuchen.

In dieser Studie werden Knockout-Mäuse mit zwei verschiedenen Nahinfrarot-Fluoreszenzsonden injiziert. Die Aortas werden 24 Stunden später geerntet und mittels NIRF-Bildgebung bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante NIRF-Antwort, die auf das Vorhandensein einer umfangreichen Verkalkung hinweist, die mit Makrophagenakkumulation kolokalisiert ist.

NIRF-Bildgebung kann auch verwendet werden, um Tumore in vivo zu lokalisieren und zu bewerten. In dieser Studie werden Gewebesimulationen von Brustphantomen mit fluoreszierenden Tumor-Simulationseinschlüssen erstellt. Die Anwendungen der NIRF-Bildgebung während der Brustkonservierungschirurgie werden dann simuliert.

Die Ergebnisse zeigen, dass tumorähnliche Einschlüsse durch NIRF bis zu einer Tiefe von etwa zwei Zentimetern nachweisbar sind. Einschlüsse, die tiefer sind, sind nachweisbar, nachdem Schnitte in das überlagernde Phantomgewebe gemacht wurden. Nachdem die Einschlüsse entfernt wurden, wertet der Chirurg die NIRF-Bilder aus. Jede verbleibende Fluoreszenz, die auf das Vorhandensein von Tumoren hinweist, weist auf eine unvollständige Entfernung hin und wird dann ausgeschnitten.

Sie haben gerade JoVeEs Einführung in die Nahinfrarot-Bildgebung miterlebt. Sie sollten nun die Prinzipien der Fluorophor-Erregung und -emission verstehen, wie Sie ein Tier auf in vivo- und ex vivo NIRF-Bildgebung vorbereiten und einige biomedizinische Anwendungen. Danke fürs Zuschauen!

Results

Repräsentative in vivo- und ex vivo NIRF-Bilder von Nagetieren mit abdominalen Aortenaneurysmen (AAAs) sind in den Abbildungen 1-2 dargestellt. Eine aktivierbare Fluoreszenzsonde wurde systemisch über die Schwanzvene injiziert, um die Matrix-Metalloproteinase-2-Aktivität (MMP2) zu visualisieren. MMP2 ist ein elastolytisches Enzym, das am Abbau der extrazellulären Matrix beteiligt ist, die eine wichtige Rolle bei der Initiierung und Progression von AAA spielt. Alle Bilder wurden mit einem 625 nm Anregungsfilter, einem 700 nm Emissionsfilter und 60 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen.

Figure 1
Abbildung 1: Ein repräsentatives in vivo NIRF-Bild einer Apolipoprotein-E-Mangelmaus, die nach infusion von Angiotensin-II eine AAA entwickelte. Die meisten der kleinen Flecken, die ein hohes Signal zeigen, stammen aus hautautofluoreszenz (gelbe Pfeile). Die Vaskulatur kann als röhrenförmige Strukturen mit hohen Fluoreszenzsignalen (roter Pfeil) visualisiert werden. Scalebar: 1 cm.

Abbildung 2 zeigt einen Anstieg der MMP2-Aktivität in der aneurysmalen Region der Bauchaorta, wie die beobachtete Zunahme der Signalintensität im Vergleich zu gesunden Regionen der Bauchaorta zeigt. Dieses Ergebnis stimmt mit den Ergebnissen in der Literatur überein, die erhöhte MMP2-Werte innerhalb von AAAs anzeigen. Überschüssige Fluoreszenzsonden wurden gefiltert und in den Nieren angesammelt, was zu hellen Fluoreszenzsignalen führte.

Figure 2
Abbildung 2: NIRF-Bilder von AAAs aus zwei verschiedenen Tiermodellen: (A) eine suprarenale AAA in Angiotensin II-infundierter Apolipoprotein-E-Mangelmaus und (B) eine infrarote AAA bei Ratte, die mit Schweinepankrease infundiert ist. Gelbe Pfeile zeigen auf die AAAs. Skalenbalken: 3 mm.

Applications and Summary

Die NIRF-Bildgebung stützt sich auf fluoreszierende Sonden, um biomolekulare Baugruppen in Geweben zu quantifizieren und zu visualisieren. Absorbierte Photonenenergie aus Nahinfrarotlicht regt fluoreszierende Moleküle zu einem höheren Energiezustand an, und das emittierte Licht mit einer längeren charakteristischen Wellenlänge wird durch ein Fluoreszenz-Bildgebungssystem erfasst. Hier wurde die Anwendung der NIRF-Bildgebung zur Untersuchung der MMP2-Aktivität bei abdominalen Aortenaneurysmen in vivo und ex vivonachgewiesen. Im Gegensatz zu SPECT oder PET, die als Goldstandards bei der Untersuchung von Stoffwechselprozessen im Körper nicht-invasiv gelten, ist NIRF-Bildgebung eine schnelle und hochdurchsatzige Bildgebungstechnik, die keine ionisierende Strahlung beinhaltet. Eine der Einschränkungen dieser Modalität ist ihre relativ geringe Eindringtiefe. Obwohl diese Einschränkung die klinische Bildgebung von tiefen Geweben schwierig macht, spielt die NIRF-Bildgebung eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von Tumoren und Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Kleintieren.

Angesichts der entsprechenden Fluoreszenzsonde können viele molekulare Strukturen mithilfe der vorgestellten NIRF-Bildgebungsverfahren visualisiert werden, um sowohl die Krankheitsinitiierung als auch das Fortschreiten in Kleintiermodellen zu untersuchen. Spezifische Ex-vivo- und In-vivo-Anwendungen umfassen 1) Die Bewertung der MMP-Aktivität in der Nagetiervaskulatur, 2) die Früherkennung von Tumoren bei verschiedenen Krebsarten und 3) die Bewertung der Nanopartikel-Pharmakokinetik und Der Bioverteilung für therapeutische Anwendungen. Zusätzlich zur erhöhten MMP2-Aktivität innerhalb von AAAs wurden andere MMP-Fluoreszenzsonden eingesetzt, um die Progression der Arteriosklerose zu untersuchen und die kardiale extrazelluläre Matrixzusammensetzung nach einem Myokardinfarkt zu charakterisieren. Darüber hinaus wurde das Fluorophor-Indocyaningrün verwendet, um Gewebeperfusion in murinen Modellen der Hinterbleibs-Ischämie zu untersuchen. Um mehr über die Anwendung der NIRF-Bildgebung bei der Krebsfrüherkennung zu erarbeiten, können tumororientierte NIRF-Farbstoffe verwendet werden, um Tumormargen zu bewerten und bei Resektionsverfahren zu helfen. Die Integration von Nahinfrarot-Fluorophoren in Nanopartikel, die für die Arzneimittelabgabe entwickelt wurden, ermöglicht es Wissenschaftlern, effektivere Nanopartikel-basierte Therapeutika für eine Vielzahl von Krankheiten zu entwickeln. Schließlich ist die Fähigkeit, das fluoreszierende Signal in ganzen Tieren oder intaktem Gewebe räumlich zu lokalisieren, ein klarer Vorteil gegenüber anderen herkömmlichen enzymatischen Assays (Gelzymographie) und Proteinanalysen (Westlicher Fleck), die eine Opferung der Tiere und eine Homogenisierung des Gewebes erfordern.

Das folgende Verfahren enthält detaillierte Schritte, die erforderlich sind, um in vivo- und ex vivo NIRF-Bilder von Kleintieren zu sammeln:

1. Experimentelle Einrichtung

  1. Verbinden Sie eine Lichtwellenleiter mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem über eine Lichtleiter.
  2. Wählen Sie den entsprechenden Anregungsfilter für das Experiment aus. Der Anregungsfilter bestimmt die Wellenlänge des Lichts, das an die Probe geliefert werden soll, und sollte so gewählt werden, dass es dem Anregungsspektrum des in die Probe eingeführten Fluorophors entspricht.
  3. Wählen Sie den entsprechenden Emissionsfilter aus. Der Emissionsfilter blockiert unerwünschte Spektralkomponenten, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können, und sollte so gewählt werden, dass sie dem Emissionsspektrum des Fluorophors entspricht.

2. Probenvorbereitung

  1. In Vivo
    1. Anästhetisieren Sie das Tier in einer Induktionskammer mit Isofluran in einer Konzentration von 3-4% auf dem Durchflussmesserzifferblatt.
    2. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf dem Bildgebungsstadium fixiert ist, und halten Sie Isofluran in einer Konzentration von 1-2%. Eine Wärmequelle ist nicht notwendig, da die Tiere in der Regel nur für einen kurzen Zeitraum abgebildet werden (> 5 min), und ihre Körpertemperatur nicht wesentlich abnimmt.
    3. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Entfernen Sie das Haar aus dem Bereich des Interesses, indem Sie eine Enthaarungscreme auftragen.
    4. Enthaarungscreme auf den kleinsten Bedarf auftragen. Nach 30 s mit einem Gazepad abwischen. Wischen Sie den Bereich ein zweites Mal mit einem Ethylalkohol befeuchteten Gazepad, um die Enthaarungscreme vollständig zu entfernen.
    5. Ophthalmologische Salbe auf die Augen auftragen, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.
    6. Injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Für diese spezifische Anwendung wurden MMP2-aktivierbare Sonden intravenös in die Schwanzvene injiziert. An diesem Punkt kann die Maus abgebildet werden. Fahren Sie mit dem "Image Acquistion" dieses Protokolls fort, um fortzufahren. Überwachen Sie das Tier während des kurzen Eingriffs auf regelmäßige atmungsaktive s.
  2. Ex Vivo
    1. Nach der Injektion der Fluoreszenzsonde, euthanisieren Sie das Tier auf humane Weise nach den AVMA-Richtlinien von 2013 für die Euthaniasie von Tieren. Die Überdosierung von Kohlendioxid(CO2) ist eine gängige Praxis für die Einschläferne von Kleintieren.
    2. Chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse und sorgfältig entfernen überschüssiges Fettgewebe mit Zange.
    3. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen und legen Sie die Probe direkt auf der bildgebenden Bühne.

3. Bildaufnahme

  1. Öffnen Sie die molekulare Bildgebungssoftware und schalten Sie sowohl die Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.
  2. Öffnen Sie das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören: Standardbelichtung zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Time Lapse Exposure zur Erfassung einer Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall und Progressive Belichtung zur Erfassung einer kontinuierlichen Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten.
  3. Wählen Sie UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle.
  4. Passen Sie mithilfe des in der Vorschau angezeigten Bildes als Referenz den Fokus der Linse, das Sichtfeld und die Blende in der Aufnahmesystemkammer an, um die abgetastete Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe an.
  5. Schließen Sie das Vorschaufenster, und stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen.
  6. Klicken Sie auf 'Expose', um das Bild zu erfassen und zu speichern.
  7. Standard-Software für molekulare Bildgebung bietet in der Regel eine Vielzahl von Analyse-, Mess- und Bildkorrekturwerkzeugen, um Fluoreszenzsignale für die Bildanalyse zu quantifizieren.
  8. Entfernen Sie am Ende der Bildgebungssitzung die Probe/das Tier, schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsphase, um Schäden am System zu minimieren.

Die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung ist eine optische Technik, bei der fluoreszierende Sonden komplexe biomolekulare Baugruppen in Geweben visualisiert werden. Diese nichtinvasive bildgebende Technik, die auch als NIRF bekannt ist, ist schnell und erfordert keine ionisierende Strahlung.

In NIRF können fluoreszierende Sonden mit kleinen Molekülen konjugiert werden, um krebs- und herzkargherzische Erkrankungen zu untersuchen. Sie werden durch Nahinfrarotlicht angeregt, das tief in das Gewebe eindringt und verwendet werden kann, um gesundes Gewebe aus krankem Gewebe abzuleiten, das die Konzentration dieser Zielmoleküle verändert.

Dieses Video wird die Prinzipien der Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung sowie die Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-Experimenten bei Kleintieren zur Untersuchung einer Vielzahl von Krankheiten veranschaulichen.

Wie der Name schon sagt, nutzt die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung Licht innerhalb des ersten Nahinfrarotfensters, das von 650 Nanometern bis 900 Nanometer reicht, um Photonen in das Gewebe zu liefern. Zielspezifische fluoreszierende Moleküle, sogenannte Fluorophore, werden in der Regel durch Gentechnik oder Injektion vor der Bildgebung in ein Tier eingeführt.

Diese Fluorophore absorbieren Photonenenergie, die die Energie der Moleküle vom Bodenzustand S0 in den instabilen angeregten Zustand S1 prime hebt. Da dieser Zustand instabil ist, werden sich die Moleküle auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau innerhalb des angeregten Zustands entspannen und ihre Energie in Form von Wärme freisetzen. Die Fluorophore, die sich nun im entspannten aufgeregten Zustand S1 befinden, kehren dann in den Bodenzustand zurück und emittieren Licht einer bestimmten Wellenlänge.

Dieses Licht hat eine längere Wellenlänge als das Licht, das ursprünglich in das Fluorophor eingeführt wurde, aufgrund der Energie, die sich in Form von Wärme ableitet, während sich das Molekül auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau entspannt. Das emittierte Licht wird dann mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem erfasst und aufgezeichnet.

Ein Diagramm der Absorptions- und Emissionsspektren für das Fluorophor zeigt den Wellenlängenbereich, den das Fluorophor aufnehmen und emittieren kann. Diese grundlegende Verschiebung, die den Unterschied in Nanometern zwischen der Spitzenabsorption und den Spitzenemissionswellenlängen darstellt, wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Jedes Fluorophor verfügt über eine eigene Stokes-Verschiebung, die es ermöglicht, das Emissionslicht vom spannenden Licht zu unterscheiden und bildgebende Verfahren wie NIRF zu ermöglichen.

Nachdem wir die wichtigsten Prinzipien der Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung überprüft haben, gehen wir nun durch das Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ein Tier vorzubereiten und abzubilden.

Verwenden Sie zunächst eine faseroptische Lichtführung, um eine lichtoptische Lichtquelle mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem zu verbinden. Wählen Sie den Anregungsfilter aus, der dem Anregungsspektrum der fluoreszenz entspricht, die in die Probe eingeführt werden soll, um sicherzustellen, dass die richtige Wellenlänge des Lichts geliefert wird.

Wählen Sie als Nächstes den geeigneten Emissionsfilter aus, um dem Emissionsspektrum des Fluorophors zu entsprechen, der unerwünschte Spektralkomponenten blockiert, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können.

Um mit der Vorbereitung auf die In-vivo-Bildgebung zu beginnen, verwenden Sie Isofluran, um das Tier in einer Knockdown-Kammer zu beanten. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf der Bildstufe fixiert ist. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um das Haar aus dem Interessenbereich zu entfernen. Dann tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.

Anschließend injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, öffnen Sie die Software für molekulare Bildgebung. Schalten Sie sowohl die faseroptische Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.

Öffnen Sie anschließend das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören standardexposure zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Zeitrafferbelichtung, um eine Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall zu erfassen, und progressive Belichtung, um eine kontinuierliche Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten zu erfassen.

Wählen Sie dann UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle aus. Passen Sie mithilfe des Vorschaubilds als Referenz den Fokus, das Sichtfeld und den F-Stopp in der Erfassungssystemkammer an, um die bildbestückte Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe nach Bedarf an. Schließen Sie anschließend das Vorschaufenster. Stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen. Klicken Sie auf "Expose", um das Bild zu erfassen und zu speichern.

Um sich auf die Ex-vivo-Bildgebung vorzubereiten, müssen Sie das Tier nach der Injektion der Fluoreszenzsonde human einschläfern. Mit Zangen, entfernen Sie sorgfältig überschüssiges periaortisches Fett. Als nächstes, chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen. Platzieren Sie die Probe dann direkt auf der Bildstufe.

Stellen Sie das Ex-vivo-Gewebe nach dem gleichen Protokoll ab, wie es für die In-vivo-Bildgebung beschrieben wurde. Wenn sie abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe von der Bühne. Schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsstufe.

Nachdem wir nun das Protokoll zum Abrufen von Nahinfrarot-Feldbildern abgeschlossen haben, sollten wir die Ergebnisse dieser Scans überprüfen.

In diesen repräsentativen Bildern wird eine aktivierbare Fluoreszenzsonde systemisch über die Schwanzvene injiziert, um die Matrix Metalloproteinase oder MMP2 zu visualisieren. Hier sehen wir ein in vivo NIRF-Bild einer apolipoprotein-E-Mangelmaus, die nach der Infusion von Angiotensin II ein abdominales Aortenaneurysm entwickelte. Während die meisten der kleinen hohen Signalflecken aus der Hautautofluoreszenz stammen, präsentiert sich die Vaskulatur visuell als röhrenförmige Strukturen mit hohen fluoreszierenden Signalen.

Das zweite repräsentative Bild vergleicht NIRF-Bilder von abdominalen Aortenaneurysmen aus zwei verschiedenen Tiermodellen. Eines, ein suprarenales abdominales Aortenaneurysm in einer Angiotensin II-infundierten Apolipoprotein-E-Mangelmaus. Und zweitens ein infrarotes Bauchaortenaneurysm bei einer Ratte, die mit schweinepankreasischer Elastase infundiert ist.

In jedem sehen wir eine Zunahme der MMP2-Aktivität in der aneurysmalen Region der Bauchaorta. Überschüssige Fluoreszenzsonden werden gefiltert und in den Nieren angesammelt, was die dort beobachteten hellen Fluoreszenzsignale erklärt.

Betrachten wir nun einige andere Anwendungen der Nahinfrarot-Feldbildgebung. Erstens kann DIE NIRF-Bildgebung verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Erkrankungen in murinen Modellen zu untersuchen.

In dieser Studie werden Knockout-Mäuse mit zwei verschiedenen Nahinfrarot-Fluoreszenzsonden injiziert. Die Aortas werden 24 Stunden später geerntet und mittels NIRF-Bildgebung bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante NIRF-Antwort, die auf das Vorhandensein einer umfangreichen Verkalkung hinweist, die mit Makrophagenakkumulation kolokalisiert ist.

NIRF-Bildgebung kann auch verwendet werden, um Tumore in vivo zu lokalisieren und zu bewerten. In dieser Studie werden Gewebesimulationen von Brustphantomen mit fluoreszierenden Tumor-Simulationseinschlüssen erstellt. Die Anwendungen der NIRF-Bildgebung während der Brustkonservierungschirurgie werden dann simuliert.

Die Ergebnisse zeigen, dass tumorähnliche Einschlüsse durch NIRF bis zu einer Tiefe von etwa zwei Zentimetern nachweisbar sind. Einschlüsse, die tiefer sind, sind nachweisbar, nachdem Schnitte in das überlagernde Phantomgewebe gemacht wurden. Nachdem die Einschlüsse entfernt wurden, wertet der Chirurg die NIRF-Bilder aus. Jede verbleibende Fluoreszenz, die auf das Vorhandensein von Tumoren hinweist, weist auf eine unvollständige Entfernung hin und wird dann ausgeschnitten.

Sie haben gerade JoVeEs Einführung in die Nahinfrarot-Bildgebung miterlebt. Sie sollten nun die Prinzipien der Fluorophor-Erregung und -emission verstehen, wie Sie ein Tier auf in vivo- und ex vivo NIRF-Bildgebung vorbereiten und einige biomedizinische Anwendungen. Danke fürs Zuschauen!

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