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Imagem de Fluorescência quase infravermelha de aneurismas abdominais
 
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Imagem de Fluorescência quase infravermelha de aneurismas abdominais

Overview

Fonte: Arvin H. Soepriatna1, Kelsey A. Bullens2, e Craig J. Goergen1

1 Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana

2 Departamento de Bioquímica, Universidade Purdue, West Lafayette, Indiana

A imagem de fluorescência quase infravermelha (NIRF) é uma técnica óptica excitante que utiliza sondas fluorescentes para visualizar conjuntos biomoleculares complexos em tecidos. A imagem NIRF tem muitas vantagens sobre os métodos convencionais de imagem para imagens não invasivas de doenças. Ao contrário da tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e tomografia de emissão de pósitrons (PET), a imagem NIRF é rápida, de alto rendimento e não envolve radiação ionizante. Além disso, desenvolvimentos recentes em sondas fluorescentes específicas e ativadas da engenharia fornecem ao NIRF alta especificidade e sensibilidade, tornando-se uma modalidade atraente no estudo de câncer e doenças cardiovasculares. O procedimento apresentado visa demonstrar os princípios por trás da imagem NIRF e como realizar experimentos in vivo e ex vivo em pequenos animais para estudar uma variedade de doenças. O exemplo específico mostrado aqui emprega uma sonda fluorescente ativante para a matriz metaloproteinase-2 (MMP2) para estudar sua absorção em dois modelos diferentes de roedores de aneurismas de aoórtico abdominal (AAAs).

Principles

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Como o nome sugere, a imagem NIRF utiliza a luz dentro da primeira janela quase infravermelha, variando de 650 nm a 900 nm, para entregar fótons no tecido. A energia, E, de um fóton é caracterizada pela Equação 1, onde h é a constante do Planck, c é a velocidade da luz em um vácuo, e λ é o comprimento de onda da luz.

Equation 1 = Equation 2 (Equação 1)

Moléculas fluorescentes específicas do alvo chamadas fluoroforos são tipicamente introduzidas no animal através de engenharia genética ou através de injeção de veias da cauda antes da imagem. Esses fluoroforos absorvem energia de fótons, o que eleva a energia das moléculas do estado terrestre, S0,para o estado instável e animado S1'. Devido à instabilidade do estado S1,as moléculas relaxam para o menor nível de energia vibracional dentro desse estado e liberam energia na forma de calor. Os fluoroforos, agora no estado relaxado e animado S1,retornam ao estado terrestre S0,emitindo luz em um comprimento de onda específico. A luz emitida, que tem um comprimento de onda mais longo devido à dissipação de energia na forma de calor, é então capturada e registrada usando um sistema de imagem de fluorescência. A mudança fundamental entre os espectros de absorção e emissão é chamada de mudança de Stokes e é importante, pois torna possível diferenciar entre a excitação e a luz de emissão.

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Procedure

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O procedimento a seguir fornece etapas detalhadas necessárias para coletar imagens in vivo e ex vivo NIRF de pequenos animais:

1. Configuração experimental

  1. Conecte uma fonte de luz de fibra óptica ao sistema de imagem de fluorescência usando um guia de luz de fibra óptica.
  2. Selecione o filtro de excitação apropriado para o experimento. O filtro de excitação determina o comprimento de onda da luz a ser entregue à amostra e deve ser escolhido para corresponder ao espectro de excitação do fluoróforo introduzido na amostra.
  3. Selecione o filtro de emissão apropriado. O filtro de emissão bloqueia componentes espectrais indesejados, que podem ser atribuídos à autofluorescência, e devem ser escolhidos para corresponder ao espectro de emissões do fluoróforo.

2. Preparação da amostra

  1. In vivo
    1. Anestesiar o animal em uma câmara de indução usando isoflurano a uma concentração de 3-4% no mostrador do esvoaçante.
    2. Transfira o animal para um cone de nariz fixado no estágio de imagem, e mantenha o isoflurane em uma concentração de 1-2%. Uma fonte de calor não é necessária porque os animais são tipicamente apenas imagens por um curto período de tempo (> 5 min), e sua temperatura corporal não diminui substancialmente.
    3. Proteja as patas do animal para minimizar os artefatos de movimento. Remova o cabelo da região de interesse aplicando um creme depilatório.
    4. Aplique creme depilatório na menor área necessária. Depois dos 30, limpe-o com uma gaze. Limpe a área uma segunda vez com uma almofada de gaze umedeçada com álcool etílico para remover completamente o creme depilatório.
    5. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar a secagem das córneas.
    6. Injete a sonda molecular fluorescente ativada no animal. Para esta aplicação específica, as sondas ativaveis MMP2 foram injetadas por via intravenosa na veia traseira. Neste ponto, o mouse pode ser imageado. Proceda ao "Acquistion de Imagem" deste protocolo para continuar. Monitore o animal para respirar regularmente durante todo o breve procedimento.
  2. Ex Vivo
    1. Após a injeção da sonda fluorescente, eutanásia o animal de forma humana de acordo com as Diretrizes avma 2013 para a eutanásia dos animais. A overdose de dióxido de carbono (CO2)é uma prática padrão para eutanásia de pequenos animais.
    2. Extrair cirurgicamente o tecido ou órgão de interesse e remover cuidadosamente o excesso de tecido adiposo com fórceps.
    3. Enxágüe o tecido em soro fisiológico tamponado para remover o sangue residual e coloque a amostra diretamente no estágio de imagem.

3. Aquisição de Imagens

  1. Abra o software de imagem molecular e ligue tanto a fonte de luz de fibra óptica quanto o sistema de imagem de fluorescência.
  2. Abra a janela de aquisição e especifique o tipo de exposição apropriada para o estudo. As exposições disponíveis incluem: Exposição padrão para capturar uma única imagem, Exposição de Lapso de Tempo para capturar uma série de imagens durante um intervalo de tempo fixo e Exposição Progressiva para capturar uma sequência contínua de exposições em diferentes momentos de exposição.
  3. Selecione UV-Transillumination como a fonte de iluminação.
  4. Usando a imagem visualizada como referência, ajuste o foco da lente, o campo de visão e a abertura f-stop/aperture na câmara do sistema de captura para otimizar a qualidade da imagem amostrada. Ajuste o tempo de exposição e a posição da amostra.
  5. Feche a janela de visualização e certifique-se de que todos os parâmetros na janela de aquisição correspondam às configurações da câmera e do filtro.
  6. Clique em 'Expor' para adquirir e salvar a imagem.
  7. O software de imagem molecular padrão normalmente fornece uma variedade de ferramentas analíticas, de medição e de correção de imagem para quantificar sinais de fluorescência para análise de imagens.
  8. No final da sessão de imagem, remova a amostra/animal, desligue o sistema e limpe o estágio de imagem para minimizar os danos ao sistema.

A imagem de fluorescência quase infravermelha é uma técnica óptica que utiliza sondas fluorescentes para visualizar conjuntos biomoleculares complexos em tecidos. Esta técnica de imagem não invasiva, que também é conhecida como NIRF, é rápida e não requer radiação ionizante.

No NIRF, as sondas fluorescentes podem ser conjugadas com pequenas moléculas para maior especificidade para estudar a progressão do câncer e das doenças cardiovasculares. Eles são animados pela luz quase infravermelha que penetra profundamente no tecido e pode ser usada para delinear tecido saudável de tecido doente que altera a concentração dessas moléculas-alvo.

Este vídeo ilustrará os princípios por trás da imagem de fluorescência quase infravermelha, bem como como realizar experimentos in vivo e ex vivo em pequenos animais para estudar uma variedade de doenças.

Como o nome sugere, a imagem de fluorescência quase infravermelha utiliza luz dentro da primeira janela quase infravermelha que varia de 650 nanômetros a 900 nanômetros para entregar fótons no tecido. Moléculas fluorescentes específicas do alvo chamadas fluoroforos são tipicamente introduzidas em um animal através de engenharia genética ou injeção antes da imagem.

Estes fluoroforos absorvem energia de fótons que eleva a energia das moléculas do estado terrestre S0 para o estado instável e animado S1 prime. Como este estado é instável, as moléculas relaxarão ao menor nível de energia vibracional dentro do estado animado liberando sua energia na forma de calor. Os fluoroforos, agora no estado relaxado e animado S1, então retornam ao estado terrestre, emitindo luz de um comprimento de onda específico.

Esta luz tem um comprimento de onda mais longo do que a luz originalmente introduzida no fluoróforo devido à energia que se dissipa na forma de calor à medida que a molécula relaxa para o menor nível de energia vibracional. A luz emitida é então capturada e registrada usando um sistema de imagem de fluorescência.

Um gráfico do espectro de absorção e emissão para o fluoróforo mostra a gama de comprimentos de onda que o fluoróforo pode absorver e emitir, respectivamente. Esta mudança fundamental, que é a diferença nos nanômetros entre o pico de absorção e os comprimentos de onda de emissão máxima, é chamada de mudança de Stokes. Cada fluoróforo tem uma mudança distinta de Stokes que permite que a luz de emissão seja distinguida da luz excitante e torna possível técnicas de imagem como o NIRF.

Tendo revisto os principais princípios da imagem de fluorescência quase infravermelha, vamos agora caminhar através do procedimento passo a passo para preparar e imaginar um animal.

Primeiro, use um guia de luz de fibra óptica para conectar uma fonte de luz de fibra óptica ao sistema de imagem de fluorescência. Selecione o filtro de excitação que corresponde ao espectro de excitação da fluorescência a ser introduzido na amostra para garantir que o comprimento de onda correto da luz seja entregue.

Em seguida, selecione o filtro de emissão adequado para corresponder ao espectro de emissão do fluoróforo que bloqueará componentes espectrais indesejados que podem ser atribuídos à autofluorescência.

Para começar a se preparar para a imagem in vivo, use isoflurane para anestesiar o animal em uma câmara de knockdown. Transfira o animal para um cone de nariz fixado no estágio de imagem. Proteja as patas do animal para minimizar os artefatos de movimento. Aplique um creme depilatório para remover o cabelo da área de interesse. Em seguida, aplique pomada oftalmômica nos olhos do animal para evitar que as córneas sequem.

Depois disso, injete a sonda molecular fluorescente ativada no animal. Para começar a aquisição de imagens, abra o software de imagem molecular. Ligue tanto a fonte de luz de fibra óptica quanto o sistema de imagem de fluorescência.

Em seguida, abra a janela de aquisição e especifique o tipo de exposição adequada para o estudo. As exposições disponíveis incluem exposição padrão para capturar uma única imagem, exposição de lapso de tempo para capturar uma série de imagens em um intervalo de tempo fixo e exposição progressiva para capturar uma sequência contínua de exposições em diferentes momentos de exposição.

Em seguida, selecione UV Transillumination como a fonte de iluminação. Usando a imagem de visualização como referência, ajuste o foco, o campo de visão e o F-stop na câmara do sistema de captura para otimizar a qualidade da imagem amostrada. Ajuste o tempo de exposição e a posição da amostra conforme necessário. Depois disso, feche a janela de visualização. Certifique-se de que todos os parâmetros na janela de aquisição correspondam às configurações da câmera e do filtro. Clique em "Expor" para adquirir e salvar a imagem.

Para se preparar para a imagem ex vivo, eutanize o animal de forma humana após a injeção da sonda fluorescente. Usando fórceps, remova cuidadosamente qualquer excesso de gordura periaórtica. Em seguida, extraia cirurgicamente o tecido ou órgão de interesse. Enxágüe o tecido em soro fisiológico tamponado para remover sangue residual. Em seguida, coloque a amostra diretamente no estágio de imagem.

Imagem do tecido ex vivo seguindo o mesmo protocolo descrito para imagens in vivo. Quando estiver completa, remova a amostra do estágio. Desligue o sistema e limpe o estágio de imagem.

Agora que completamos o protocolo para obter imagens de campo quase infravermelhas, vamos rever os resultados dessas varreduras.

Nestas imagens representativas, uma sonda fluorescente ativada é injetada sistematicamente através da veia traseira para visualizar a Matrix Metaloproteinase ou MMP2. Aqui vemos uma imagem in vivo NIRF de um camundongo deficiente apolipoprotein-E que desenvolveu um aneurisma de ao mesmo coração abdominal após infusão de angiotensina II. Enquanto a maioria dos pequenos pontos de sinal alto são de autofluorescência da pele, a vasculatura apresenta visualmente como estruturas tubulares com sinais fluorescentes elevados.

A segunda imagem representativa compara imagens de NIRF de aneurismas de aoórtico abdominal de dois modelos animais diferentes. Um, um aneurisma de aoótico abdominal suprarenal em um rato deficiente de apolipoproteína-E infundido por angiotensina II. E segundo, um aneurisma de aoótico abdominal infra-renal em um rato infundido com elastase pancreática porcina.

Em cada um, vemos um aumento da atividade MMP2 na região aneurismal da aorta abdominal. O excesso de sondas fluorescentes são filtrados e acumulados nos rins, explicando os sinais fluorescentes brilhantes observados lá.

Vamos agora olhar para algumas outras aplicações de imagens de campo quase infravermelha. Primeiro, a imagem NIRF pode ser usada para estudar doenças cardiovasculares em modelos murinos.

Neste estudo, ratos nocauteados são injetados com duas diferentes sondas fluorescentes quase infravermelhas. As aortas são colhidas 24 horas depois e avaliadas via imagem NIRF. Os resultados mostram uma resposta significativa do NIRF, indicando a presença de calcificação extensiva que co-localiza com o acúmulo de macrófagos.

As imagens do NIRF também podem ser usadas para localizar e avaliar tumores in vivo. Neste estudo, são criados tecidos que simulam fantasmas mamários contendo tumor fluorescente simulando inclusões. As aplicações de imagens NIRF durante a cirurgia de conservação da mama são então simuladas.

Os resultados mostram que inclusões semelhantes a tumores são detectáveis pelo NIRF até uma profundidade de aproximadamente dois centímetros. Inclusões mais profundas do que isso são detectáveis depois que incisões são feitas no tecido fantasma sobreposto. Após a retirada das inclusões, o cirurgião avalia as imagens do NIRF. Qualquer fluorescência restante, que indica a presença de tumores, indica remoção incompleta e, em seguida, é extirpada.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE para imagens quase infravermelhas. Agora você deve entender os princípios de excitação e emissão fluoróvia, como preparar um animal para imagens in vivo e ex vivo NIRF, e algumas aplicações biomédicas. Obrigado por assistir!

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Results

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As imagens representativas in vivo e ex vivo NIRF tiradas de roedores com aneurismas de aoórtico abdominal (AAAs) são mostradas nas Figuras 1-2. Uma sonda fluorescente ativada foi injetada sistematicamente através da veia traseira para visualizar a atividade da matriz metaloproteinase-2 (MMP2). MMP2 é uma enzima elastolítica envolvida na degradação da matriz extracelular que desempenha um papel importante na iniciação e progressão do AAA. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um filtro de excitação de 625 nm, um filtro de emissão de 700 nm e um tempo de exposição de 60 segundos.

Figure 1
Figura 1: Um representante in vivo NIRF imagem de um rato deficiente e apolipoproteína que desenvolveu um AAA após infusão de angiotensina-II. A maioria das pequenas manchas que mostram sinal alto são de autofluorescência de pele (setas amarelas). A vasculatura pode ser visualizada como estruturas tubulares com sinais de alta fluorescência (seta vermelha). Barra de escala: 1 cm.

A Figura 2 mostra um aumento da atividade MMP2 na região aneurismal da aorta abdominal, como visto pelo aumento observado na intensidade do sinal em relação às regiões saudáveis da aorta abdominal. Este resultado é consistente com os resultados na literatura que mostram níveis elevados de MMP2 dentro dos AAAs. O excesso de sondas fluorescentes foi filtrado e acumulado nos rins, levando a sinais fluorescentes brilhantes.

Figure 2
Figura 2: Imagens nirf de AAAs de dois modelos animais diferentes: (A) um AAA suprarenal em apolipoprotein-E deficiente angiotensin II e (B) um AAA infra-alo em rato infundido com elastase pancreática porcina. Setas amarelas apontam para os AAAs. Barras de escala: 3 mm.

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Applications and Summary

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A imagem NIRF conta com sondas fluorescentes para quantificar e visualizar conjuntos biomoleculares em tecidos. A energia de fóton absorvida da luz infravermelha excita moléculas fluorescentes a um estado de energia mais alta, e a luz emitida com um comprimento de onda característico mais longo é capturada por um sistema de imagem de fluorescência. Aqui, foi demonstrada a aplicação de imagens NIRF para estudar atividade MMP2 em aneurismas abdominais de ao sótão in vivo. Ao contrário do SPECT ou PET, que são considerados os padrões de ouro no estudo de processos metabólicos no corpo de forma não invasiva, a imagem NIRF é uma técnica de imagem rápida e de alto rendimento que não envolve radiação ionizante. Uma das limitações dessa modalidade é sua profundidade de penetração relativamente pequena. Embora essa limitação torne a imagem clínica de tecidos profundos desafiadora, a imagem do NIRF desempenha um papel importante no estudo de tumores e doenças cardiovasculares em animais de pequeno porte.

Dada a sonda fluorescente apropriada, muitas estruturas moleculares podem ser visualizadas usando os procedimentos de imagem NIRF apresentados para estudar tanto a iniciação da doença quanto a progressão em pequenos modelos animais. Aplicações específicas ex vivo e in vivo incluem 1) avaliação da atividade de MMP na vasculatura de roedores, 2) detecção precoce de tumores em diferentes tipos de cânceres, e 3) avaliação de farmacocinética nanopartícula e biodistribuição para aplicações terapêuticas. Além do aumento da atividade de MMP2 dentro dos AAAs, outras sondas fluorescentes MMP foram utilizadas para estudar a progressão da aterosclerose e para caracterizar a composição da matriz extracelular cardíaca após um infarto do miocárdio. Além disso, o fluorofora verde indocyanine tem sido usado para estudar a perfusão de tecido em modelos murinos de isquemia hindlimb. Para elaborar mais sobre a aplicação de imagens DE NIRF na detecção precoce do câncer, os corantes NIRF direcionados ao tumor podem ser usados para avaliar as margens tumorais e auxiliar nos procedimentos de ressecção. A integração de fluoroforos quase infravermelhos em nanopartículas desenvolvidas para a entrega de medicamentos permite que os cientistas desenvolvam terapêuticas mais eficazes baseadas em nanopartículas para uma variedade de doenças. Por fim, a capacidade de localizar espacialmente o sinal fluorescente em animais inteiros ou tecido intacto é uma clara vantagem sobre outros ensaios enzimáticos convencionais (zymografia de gel) e análise de proteínas (mancha ocidental) que exige que os animais sejam sacrificados e tecidos sejam homogeneizados.

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