インフラレナル大オルタにおける血液と脂質を画像化する光音響断層撮影

Biomedical Engineering

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Overview

出典:ガーニート・S・サンガとクレイグ・J・ガーゲン, ウェルドン生物医工学研究科, パデュー大学, ウェストラファイエット, インディアナ州

光音響断層撮影(PAT)は、光発生音波を利用して組織から組成情報を得る新たな生物医学的イメージングモダリティです。PATは、血液および脂質成分を画像化するために使用することができ、これは、心血管および腫瘍イメージングを含む多種多様な用途に有用である。現在使用されているイメージング技術には、研究者や医師との使用を制限する固有の制限があります。例えば、長い取得時間、高コスト、有害なコントラストの使用、および高侵襲性への最小限の要因はすべて、実験室および診療所における様々なモダリティの使用を制限する要因である。現在、PATに匹敵する唯一のイメージング技術は、新たな光学技術です。しかし、これらはまた、浸透の限られた深さと外因性造影剤の必要性などの欠点を有する。PAT は、迅速で非侵襲的なラベルのない方法で意味のある情報を提供します。超音波と組み合わせると、PATは組織から構造的、馬力学的、および組成情報を得るために使用することができ、それによって現在使用されているイメージング技術を補完する。PATの利点は前臨床および臨床環境の両方で影響を与える機能を示す。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. バイオメディカルエンジニアリング. インフラレナル大オルタにおける血液と脂質を画像化する光音響断層撮影. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

PATは、光誘起音響波を利用して組織から組成情報を得るハイブリッドモダリティです。音響伝播は熱弾性膨張に起因する。これは、組織内の特定の化学結合が光を吸収し、周囲温度の上昇が組織を拡大させるときに発生します。精巧にするために、特定の化学結合は光を吸収し、分子が振動し、この振動エネルギーの一部を熱に変換します。熱のこの生産は、超音波トランスデューサーによって検出することができる音響伝播を誘発する局所組織膨張を引き起こす。光音響効果を誘導するには、放熱を最小限に抑え、熱弾性誘導圧力が組織内に蓄積されるように、熱閉じ込め条件と応力閉じ込め条件の両方を満たす必要があります。得られた光音響圧力波は、光誘起音響波(Po)が温度依存性グルエニセンパラメータ(Γ)、吸収係数(μa)、および局所光フルエンス(F)によって支配されることを示す式(1)によって特徴付けることができる。

Po = ΓμaF 方程式 1

その結果、温度の各mK上昇は、特徴的に超音波トランスデューサを使用して検出することができる800パスカル圧力波を生成します。この光の結合選択的吸収により、1100nm光を使用して血液を標的にし、1210nm光を使用して脂質を標的とするなど、様々な生体成分を標的とすることができます。さらに、光は音響波の伝播を誘導するために使用されているので、この技術は、通常、造影剤や侵襲的な手順を必要とせずに、他の光学技術よりも深い構造を画像化するために使用することができます。第2の近赤外窓光に長波長光を使用して音響波を誘導するこの特定の方法は、ユーザに多くの利点を提供し、振動PAT(またはVPAT)を広範囲の生物医学用途に潜在的に使用することを可能にする。

Procedure

次の手順では、アポリポプロテイン-E欠損(apoE-/-)マウスにおけるインフラレナル大定の血液および脂質イメージングのためのVPATを設定するために必要な方法について説明します。

1. レーザー超音波カップリング

  1. Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザーと超音波システムを取得します。パルス発生器、1本のBNCケーブル、2本のBNCケーブルに接続されたDコネクタを取得します。
  2. Dコネクタのセットアップを使用して、パルス発生器のポートAに「Fire」BNCケーブルを接続し、パルス発生器のポートBに「Qスイッチ」を接続します。最後に、ポートCからBNCケーブルを取り付け、超音波システムの背面にある「トリガイン」します。
  3. 光ファイバケーブルをレーザーに合わせ、40 MHz超音波トランスデューサの側面にファイバーエンドを取り付けます。
  4. ポート A、B、および C の遅延を、ここに示す値に調整します(ポート A: 0.000000000、ポート B: 0.00021440、ポート C: 0.00000910)。ポート A と B を反転信号に設定し、ポート C を通常の信号に設定します。

2. 動物の調製と画像取得

  1. 麻酔誘導室で3%のイソフルランを用いてapoE-/-マウスを麻酔する。動物が麻酔されたら、マウスを鼻コーンに移動して、1〜2%のアイソフルランを送出します。
  2. 角膜乾燥を防ぐために、動物の目に目の潤滑を適用します。マウスの足を加熱段階に組み込んだ電極にテープで貼り付け、動物の呼吸と心拍数を監視します。最後に、直腸プローブを挿入して体温を監視します。
  3. 動物の腹部から毛を取り除くために脱毛クリームを適用します。ガーゼパッドで30s後に拭き取る。
  4. 超音波トランスデューサを動物の腹部に置き、インフラレナル大成を見つけます。左腎静脈と尾動脈への大動脈三色は、ユーザーがこの領域を見つけるのに役立つ2つのランドマークです。
  5. レーザーを実行して1100 nmの光を出力し、続いて1210 nmの光をターゲット脂質に出力します。レーザーを使用する場合は、適切なレーザー安全ゴーグルを使用してください。

光音響断層撮影、PATは、光音響断層撮影とも呼ばれ、光発生音波を利用して組織から組成情報を得る新たな生物医学的イメージングモダリティである。

光音響断層撮影、またはPATは、組織の特定の成分を画像化するために光の特定の波長を使用します。これは、脂質ベースの疾患の進行を監視するなど、多種多様な前臨床および臨床応用に有用である。

現在使用されているイメージング技術は、取得時間、浸透深度、有害な対照剤の使用、およびコストの点で本質的に制限されています。一方、PATは、超音波のような既存の画像モダリティと組み合わせることで、構造的および組成情報を同時に提供することができる、迅速で非侵襲的で、造影剤のない技術です。

このビデオでは、振動PATの基本原理と、マウスの血液および脂質イメージングを設定する方法論を説明します。次に、超音波と組み合わせてVPAT画像を解釈する方法をデモンストレーションし、その後、この技術のいくつかのアプリケーションを示します。

まず、このイメージング技術の基礎について説明します。

VPATイメージング中、レーザー光源からの単一波長光が対象領域に表示されます。この光は、その後、生体組織中の波長特異的な化学結合によって吸収される。VPATでは、吸収された光が分子を振動させます。

この振動エネルギーの一部は、過渡加熱に変換されます。熱のこの生産は、その後、局所組織の熱弾性膨張を引き起こし、その結果、超音波伝播を生成します。これを光音響効果といいます。超音波トランスデューサによる超音波の検出は、組成物特異的な断層画像を生み出す。

数学的には、光誘起音響波P naughtは、温度依存性グルナイゼンパラメータガンマ、吸収係数mua、および局所光学フルエンスFによって支配される。したがって、温度のミリケルビン上昇ごとに、超音波トランスデューサを用いて検出できる800パスカル圧力波がある。この光の結合選択的吸収により、ユーザーは光の波長を調整することによって様々な生物学的成分を標的とすることができます。

例えば、1,100ナノメートルの光を使用して血液を標的にし、1,210ナノメートルの光を使用して脂質を標的にします。さらに、光は音響波の伝播を誘導するために使用されているので、この技術は、通常、造影剤や侵襲的な手順を必要とせずに、他の光学技術よりも深い構造を画像化するために使用することができます。

VPATの基本を見直した後、アポリポタンパク質E欠損マウスのインフラレナル大オルタで血液と脂質を画像化するためにVPATを設定して実行する方法の例を見てみましょう。

まず、Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザー、超音波システム、遅延発生器、および2本のBNCケーブルに接続されたDコネクタ:Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザーを取得します。次に、遅延発生器のポート A に Fire BNC ケーブルを接続し、Q スイッチを遅延ジェネレータのポート B に接続します。ポート C から BNC ケーブルの端を接続して、超音波システムの背面にトリガーします。

ポート A、B、および C の遅延を、ここに示す値に調整します。ポート A と B は特に反転パルスを出力し、ポート C は通常のパルスを出力する必要があります。次に、光ファイバケーブルをレーザーに位置合わせし、40メガヘルツ超音波トランスデューサの側面に繊維端を取り付けます。

それでは、光音響断層撮影のために動物を準備する方法をデモンストレーションしましょう。

まず、ノックダウンチャンバーで3%のイソフルランを用いてアポリポタンパク質E欠損マウスを麻酔する。動物が麻酔されたら、マウスを加熱ステージに移動し、鼻コーンを固定して1〜2%のアイフルランを送ります。角膜乾燥を防ぐために、動物の目に眼の潤滑剤を塗布します。マウスの足を加熱段階に組み込んだ電極にテープで貼り付け、動物の呼吸と心拍数を監視します。最後に、直腸プローブを挿入して体温を監視します。

次に、脱毛クリームを塗布して動物の腹部全体から毛髪を取り除きます。超音波トランスデューサを動物の腹部に置き、インフラレナル大成を見つけます。左腎静脈と尾動脈への大動脈三色は、ユーザーがこの領域を見つけるのに役立つ2つのランドマークです。

画像の取得を開始するには、B モードを押してライブ B モードの画像を表示します。2Dゲインノブとフォーカスノブを使用してゲインを調整します。[深度オフセット]、[イメージの幅]、および [イメージの奥行き] ボタンを使用して、イメージの幅と奥行きを調整します。

その後、レーザーをオンにします。PAモードを押すと、ライブBモードとPA画像が表示されます。2Dゲインノブを使用してPAゲインを調整し、画面上のPAウィンドウとカラーマップを調整します。1,100ナノメートルの光でレーザーを走らして血液を標的にし、続いて1,210ナノメートルの光を走らして脂質を標的にします。

それでは、生体内で脂質および血液特異的イメージングを行うVPATプロトコルの結果を確認してみましょう。

超音波イメージングは、インフラレナル大オルタに関する構造情報を得ることを可能にした。これは、VPAT 構成情報をより適切に解釈するために使用できます。具体的には、1,100ナノメートルの光が大動脈内の血液を画像化し、1,210ナノメートルの光は皮下および骨膜脂肪蓄積を画像化した。

これらの画像から見ると、皮下脂肪は皮膚の幾何学的形状に従う。しかし、会渦性脂肪は大動脈の輪郭に従い、血液信号は大動脈内から発生します。

光音響断層撮影は、多種多様な前臨床および臨床応用に使用することができる。

生体内の小動物イメージングは前臨床試験において重要な役割を果たし、光音響断層撮影は近赤外光を用いて電子吸収を検出し、神経生物学的応用に対する深部脳機能の高解像度イメージングを可能にする。ヘモグロビン酸素化、血管解剖学、および血流に関する正確なデータが収集されます。この内部脳イメージング情報は、正常および病理学的脳組織を評価するために使用することができる。

血管内科では、静脈や動脈を可視化し、その機能性を評価することが重要です。光音響断層撮影は、プラークを脆弱または安定なものとして特徴付ける組成情報を提供し、どのプラークが破裂しやすいかを予測するのに役立ち、心筋梗塞や虚血性脳卒中を引き起こす可能性があります。

あなたはちょうどJoVEのフォトアコースティック断層撮影の紹介を見ました。このイメージング技術の基本原則を理解し、動物を画像化し、結果を解釈できるようになる必要があります。見ていただきありがとうございます!

Results

ここで、VPAT法は、生体内で脂質および血液特異的イメージングを行うために使用された。レーザーと超音波システムを結合することにより、光を組織に送達し、得られた音響波を検出した。超音波イメージングにより、VPAT組成情報をより良く解釈するために使用できるインフラレナル大成(図1a)の構造情報を得ることができます。具体的には、1100nm光を使用して大動脈内の血液を画像化し(図1b)、1210nm光を用いて皮下および腹膜脂肪蓄積を画像化した(図1c)。超音波およびVPAT画像から、皮下脂肪が皮膚の幾何学的形状に従い、骨膜脂肪が大動脈の輪郭に従い、血液信号が大動脈内から発生することがわかります。これらの結果は、実際に、VPATが生体内の血液および脂質蓄積を画像化するために使用できることを確認する。

Figure 1
図1: 超音波(左)、血液VPAT(中央)、および脂質VPAT(右)のApoEの画像-/-.皮下脂肪(白い矢印)、骨膜炎(オレンジ色の矢印)、血液(赤い矢印)がはっきりと見えます。

Applications and Summary

VPATは、生体内で血液および脂質蓄積を画像化するための迅速な、非侵襲的、ラベルフリーの方法です。パルスレーザー光を組織に送り出すことで、音響伝播は相対密度を得て生体成分を見つけ出す誘導を行った。超音波イメージングと組み合わせることで、組成、ならびに組織からの構造的および馬力的情報を解決することができる。この技術の現在の制限は、脂質ベースのイメージングのためにおよそ3ミリメートルであるその浸透深さです。これは現在の光学技術よりも優れていますが、光送達技術の改良は浸透の深さを改善します。これを改善する1つの方法は、反射光を組織にリダイレクトしながら、目的の領域への光送達を最大化する光音響トランスデューサを開発することです。VPATはまだ初期段階にあるイメージング技術ですが、近年大きな関心を寄けており、今後、より多くの研究室や診療所で使用される可能性が高い。

記載されたプロトコルは、前臨床および臨床空間の両方で多種多様な適用に使用することができる。3つの潜在的なVPATアプリケーションは、1)脂質ベースの疾患進行を研究する技術を利用すること、2)有望な治療薬を評価し、3)脂質ベースの疾患の診断を改善することを含む。構造的、ヘ動的、および組成情報を追跡する能力により、VPATは血管脂質が小動物モデルにどのように蓄積するかを研究する魅力的な技術になります(図1)。また、VPATは非侵襲的な方法であるため、縦方向の研究における治療薬の効果を評価するために適用することができる。これは特に治療の検証に必要な動物の数を減らすことによって研究のコストを下げる可能性があります。最後に、VPATが組成情報を提供する能力は、頸動脈および末梢動脈疾患のようなアテローム硬化性関連疾患に罹患している患者において、異なるタイプのプラークを画像化する魅力的な技術となる。心血管医学における現在の課題の一つは、どのプラークが破裂しやすいかを予測し、心筋梗塞や虚血性脳卒中を誘発する可能性を秘めていることです。したがって、VPATはまた、生物学的成分を区別する能力のために、脆弱なプラークと安定したプラークを特徴付ける上で重要な役割を果たし得る。一緒に考えて、VPATは医学の研究と臨床の両方に大きな影響を与える可能性を秘めています。

材料一覧

名前 会社 カタログ番号 コメント
VPAT機器
超音波システム ビジュアルソニックス Vevo2100
Nd:YAG OPOレーザー 連続 スレライトEX
サファイアパルス発生器 量子作曲家 9200 4 ポートが必要
BNCケーブル トールラボ 2249-C-120 外径0.2''、BNCケーブルの長さは、ユーザーの好みに依存します。
2 本の BNC ケーブルに接続された B コネクタ L-com CTL4CAD-1.5 連続体はまた、このコネクタを提供します
オプティカルゴーグル レーザーシールド #37 0914 UV400 OD 7+のゴーグルで十分です。

次の手順では、アポリポプロテイン-E欠損(apoE-/-)マウスにおけるインフラレナル大定の血液および脂質イメージングのためのVPATを設定するために必要な方法について説明します。

1. レーザー超音波カップリング

  1. Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザーと超音波システムを取得します。パルス発生器、1本のBNCケーブル、2本のBNCケーブルに接続されたDコネクタを取得します。
  2. Dコネクタのセットアップを使用して、パルス発生器のポートAに「Fire」BNCケーブルを接続し、パルス発生器のポートBに「Qスイッチ」を接続します。最後に、ポートCからBNCケーブルを取り付け、超音波システムの背面にある「トリガイン」します。
  3. 光ファイバケーブルをレーザーに合わせ、40 MHz超音波トランスデューサの側面にファイバーエンドを取り付けます。
  4. ポート A、B、および C の遅延を、ここに示す値に調整します(ポート A: 0.000000000、ポート B: 0.00021440、ポート C: 0.00000910)。ポート A と B を反転信号に設定し、ポート C を通常の信号に設定します。

2. 動物の調製と画像取得

  1. 麻酔誘導室で3%のイソフルランを用いてapoE-/-マウスを麻酔する。動物が麻酔されたら、マウスを鼻コーンに移動して、1〜2%のアイソフルランを送出します。
  2. 角膜乾燥を防ぐために、動物の目に目の潤滑を適用します。マウスの足を加熱段階に組み込んだ電極にテープで貼り付け、動物の呼吸と心拍数を監視します。最後に、直腸プローブを挿入して体温を監視します。
  3. 動物の腹部から毛を取り除くために脱毛クリームを適用します。ガーゼパッドで30s後に拭き取る。
  4. 超音波トランスデューサを動物の腹部に置き、インフラレナル大成を見つけます。左腎静脈と尾動脈への大動脈三色は、ユーザーがこの領域を見つけるのに役立つ2つのランドマークです。
  5. レーザーを実行して1100 nmの光を出力し、続いて1210 nmの光をターゲット脂質に出力します。レーザーを使用する場合は、適切なレーザー安全ゴーグルを使用してください。

光音響断層撮影、PATは、光音響断層撮影とも呼ばれ、光発生音波を利用して組織から組成情報を得る新たな生物医学的イメージングモダリティである。

光音響断層撮影、またはPATは、組織の特定の成分を画像化するために光の特定の波長を使用します。これは、脂質ベースの疾患の進行を監視するなど、多種多様な前臨床および臨床応用に有用である。

現在使用されているイメージング技術は、取得時間、浸透深度、有害な対照剤の使用、およびコストの点で本質的に制限されています。一方、PATは、超音波のような既存の画像モダリティと組み合わせることで、構造的および組成情報を同時に提供することができる、迅速で非侵襲的で、造影剤のない技術です。

このビデオでは、振動PATの基本原理と、マウスの血液および脂質イメージングを設定する方法論を説明します。次に、超音波と組み合わせてVPAT画像を解釈する方法をデモンストレーションし、その後、この技術のいくつかのアプリケーションを示します。

まず、このイメージング技術の基礎について説明します。

VPATイメージング中、レーザー光源からの単一波長光が対象領域に表示されます。この光は、その後、生体組織中の波長特異的な化学結合によって吸収される。VPATでは、吸収された光が分子を振動させます。

この振動エネルギーの一部は、過渡加熱に変換されます。熱のこの生産は、その後、局所組織の熱弾性膨張を引き起こし、その結果、超音波伝播を生成します。これを光音響効果といいます。超音波トランスデューサによる超音波の検出は、組成物特異的な断層画像を生み出す。

数学的には、光誘起音響波P naughtは、温度依存性グルナイゼンパラメータガンマ、吸収係数mua、および局所光学フルエンスFによって支配される。したがって、温度のミリケルビン上昇ごとに、超音波トランスデューサを用いて検出できる800パスカル圧力波がある。この光の結合選択的吸収により、ユーザーは光の波長を調整することによって様々な生物学的成分を標的とすることができます。

例えば、1,100ナノメートルの光を使用して血液を標的にし、1,210ナノメートルの光を使用して脂質を標的にします。さらに、光は音響波の伝播を誘導するために使用されているので、この技術は、通常、造影剤や侵襲的な手順を必要とせずに、他の光学技術よりも深い構造を画像化するために使用することができます。

VPATの基本を見直した後、アポリポタンパク質E欠損マウスのインフラレナル大オルタで血液と脂質を画像化するためにVPATを設定して実行する方法の例を見てみましょう。

まず、Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザー、超音波システム、遅延発生器、および2本のBNCケーブルに接続されたDコネクタ:Nd:YAGパルス光パラメトリック発振器レーザーを取得します。次に、遅延発生器のポート A に Fire BNC ケーブルを接続し、Q スイッチを遅延ジェネレータのポート B に接続します。ポート C から BNC ケーブルの端を接続して、超音波システムの背面にトリガーします。

ポート A、B、および C の遅延を、ここに示す値に調整します。ポート A と B は特に反転パルスを出力し、ポート C は通常のパルスを出力する必要があります。次に、光ファイバケーブルをレーザーに位置合わせし、40メガヘルツ超音波トランスデューサの側面に繊維端を取り付けます。

それでは、光音響断層撮影のために動物を準備する方法をデモンストレーションしましょう。

まず、ノックダウンチャンバーで3%のイソフルランを用いてアポリポタンパク質E欠損マウスを麻酔する。動物が麻酔されたら、マウスを加熱ステージに移動し、鼻コーンを固定して1〜2%のアイフルランを送ります。角膜乾燥を防ぐために、動物の目に眼の潤滑剤を塗布します。マウスの足を加熱段階に組み込んだ電極にテープで貼り付け、動物の呼吸と心拍数を監視します。最後に、直腸プローブを挿入して体温を監視します。

次に、脱毛クリームを塗布して動物の腹部全体から毛髪を取り除きます。超音波トランスデューサを動物の腹部に置き、インフラレナル大成を見つけます。左腎静脈と尾動脈への大動脈三色は、ユーザーがこの領域を見つけるのに役立つ2つのランドマークです。

画像の取得を開始するには、B モードを押してライブ B モードの画像を表示します。2Dゲインノブとフォーカスノブを使用してゲインを調整します。[深度オフセット]、[イメージの幅]、および [イメージの奥行き] ボタンを使用して、イメージの幅と奥行きを調整します。

その後、レーザーをオンにします。PAモードを押すと、ライブBモードとPA画像が表示されます。2Dゲインノブを使用してPAゲインを調整し、画面上のPAウィンドウとカラーマップを調整します。1,100ナノメートルの光でレーザーを走らして血液を標的にし、続いて1,210ナノメートルの光を走らして脂質を標的にします。

それでは、生体内で脂質および血液特異的イメージングを行うVPATプロトコルの結果を確認してみましょう。

超音波イメージングは、インフラレナル大オルタに関する構造情報を得ることを可能にした。これは、VPAT 構成情報をより適切に解釈するために使用できます。具体的には、1,100ナノメートルの光が大動脈内の血液を画像化し、1,210ナノメートルの光は皮下および骨膜脂肪蓄積を画像化した。

これらの画像から見ると、皮下脂肪は皮膚の幾何学的形状に従う。しかし、会渦性脂肪は大動脈の輪郭に従い、血液信号は大動脈内から発生します。

光音響断層撮影は、多種多様な前臨床および臨床応用に使用することができる。

生体内の小動物イメージングは前臨床試験において重要な役割を果たし、光音響断層撮影は近赤外光を用いて電子吸収を検出し、神経生物学的応用に対する深部脳機能の高解像度イメージングを可能にする。ヘモグロビン酸素化、血管解剖学、および血流に関する正確なデータが収集されます。この内部脳イメージング情報は、正常および病理学的脳組織を評価するために使用することができる。

血管内科では、静脈や動脈を可視化し、その機能性を評価することが重要です。光音響断層撮影は、プラークを脆弱または安定なものとして特徴付ける組成情報を提供し、どのプラークが破裂しやすいかを予測するのに役立ち、心筋梗塞や虚血性脳卒中を引き起こす可能性があります。

あなたはちょうどJoVEのフォトアコースティック断層撮影の紹介を見ました。このイメージング技術の基本原則を理解し、動物を画像化し、結果を解釈できるようになる必要があります。見ていただきありがとうございます!

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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