Immunhistochemie und Immunzytochemie: Gewebebildgebung mittels Lichtmikroskopie

Immunology

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Concepts

Quelle: Michael S. Lee1 und Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201

Immunhistochemie (IHC) und Immunzytochemie (ICC) sind Techniken, die verwendet werden, um die Expression und Lokalisierung spezifischer Antigene mit Antikörpern zu visualisieren. Die erste veröffentlichte Anwendung von IHC war 1941, als Albert Coons die Technik benutzte, um das Vorhandensein von Pneumokokken-Antigen in Gewebeabschnitten von Mäusen zu visualisieren, die mit Pneumokokken infiziert waren (1). Der Name, Immunhistochemie, leitet sich von den Wurzeln "immuno-" in Bezug auf Antikörper und "Histo-" in Bezug auf die gewebeabschnitte ab, die in IHC verwendet werden. Die Wurzel "Cyto-" in der Immunzytochemie unterstreicht den entscheidenden Unterschied zwischen ICC und IHC. Während IHC Teile des gesamten Gewebes verwendet, verwendet ICC Zellen, die aus Gewebe isoliert oder in Kultur gewachsen sind. Der Unterschied in den verwendeten Proben bedeutet, dass die Probenvorbereitung technisch zwischen IHC und ICC unterschiedlich ist, aber ansonsten sind die Protokolle für ICC und IHC identisch und man wird feststellen, dass die Begriffe häufig austauschbar verwendet werden.

Sowohl bei IHC als auch bei ICC werden Antikörper mit chemischen oder fluoreszierenden Tags, wie Peroxidase bzw. Rhodalin, verwendet, um die Verteilung jedes Antigens von Interesse durch spezifische Bindung des markierten Antikörpers an das Antigen zu visualisieren. Im Falle von IHC werden dünne Gewebescheiben auf einem Dia immobilisiert, um die Struktur des Gewebes zu erhalten, bevor es gebeizt wird, was die Visualisierung von Antigenen im Kontext ganzer Gewebe ermöglicht (Abbildung 1). Im Falle von ICC werden Zellen gleichmäßig auf einem Dia verteilt, bevor sie gefärbt werden, was die Visualisierung der Antigenverteilung innerhalb einzelner Zellen ermöglicht, aber nicht innerhalb der Struktur eines bestimmten Gewebes. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den beiden Protokollen wird sich dieses Protokoll auf IHC konzentrieren, um die zusätzlichen Komplexitäten der Probenvorbereitung im Zusammenhang mit IHC zu beheben.

Figure 1
Abbildung 1: Gliederung des IHC-Protokolls. Visuelle Umriss eines IHC-Protokolls für paraffinintegriertes Gewebe, das von einer Maus seziert wurde. Dieses Protokoll verwendet einen biotinylierten Sekundärantikörper und Strepavidin-HRP, um die Position der Antikörperbindung zu visualisieren. Andere Optionen, wie fluoreszierend markierte Antikörper, sind ebenfalls möglich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die erste wichtige Entscheidung bei der Durchführung von IHC ist, wie die Gewebeabschnitte vorbereitet werden, um die Struktur des Gewebes während des gesamten Färbeprozesses zu erhalten. Die beiden wichtigsten Optionen sind formalin-feste Abschnitte von Paraffin-eingebettetem Gewebe oder frische Abschnitte von gefrorenem Gewebe. Es gibt keine einfache Antwort darauf, welche Methode verwendet werden soll, da es davon abhängt, welche nachgelagerte Analyse durchgeführt wird. Formalin-Fixierung von Paraffin eingebetteten Geweben wird im Allgemeinen gedacht, um Gewebemorphologie für eine optimale Bildgebung besser zu erhalten, während das Einfrieren von frischem Gewebe die Proteinfunktion für nachfolgende Assays außerhalb von IHC erhalten kann. Darüber hinaus haben sich frisch gefrorene Gewebeabschnitte als besser für die Genexpressionsanalyse geeignet erwiesen (2). Eine dritte Überlegung ist, ob die Antikörper für Ihr Antigen von Interesse für feste oder gefrorene Gewebeabschnitte geeignet sind, da einige Antikörper nur für eine bestimmte Art von Abschnitt optimiert wurden und möglicherweise nicht für andere arbeiten. Schließlich muss auch festgestellt werden, wie lange sie die Gewebeabschnitte lagern müssen, da frische gefrorene Proben bei -80°C aufbewahrt werden müssen und nicht länger als ein Jahr dauern dürfen, während feste Abschnitte viel länger bei Raumtemperatur gelagert werden können. Dies sind einige der wichtigsten Überlegungen, um zu bestimmen, ob formalin-feste Abschnitte von Paraffin-eingebettetem Gewebe oder frische Abschnitte von gefrorenem Gewebe verwendet werden sollen. Letztlich, wenn man genug Gewebe hat, kann es am besten sein, nur einige von beiden zu haben.

In diesem Experiment machten wir uns daran, festzustellen, ob die Cyclin-D1-Expression in vergrößerten Milz aus einem spontanen Mausmodell der Lymphomentwicklung erhöht wurde. Splenic-Gewebeproben wurden zuerst entweder von Wildtyp-Mäusen, transgenen Mäusen ohne Lymphom oder transgenen Mäusen, die spontan Lymphom entwickelt haben, isoliert. Die Milzgewebeproben wurden in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, mit einem Maus-Anti-Cyclin-D1-Primärantikörper, gefolgt von einem Pferde-Anti-Maus-Sekundärantikörper, gebeizt und mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB) entwickelt. Die Abschnitte wurden dann in Harris Hematoxylin Solution gegenstainiert und dann wurden die Abschnitte bei 20-facher Vergrößerung abgebildet.

Reagenzien

Paraffin-Eingebettete Abschnitte

  1. 4% Paraformaldehyd (PFA)
  2. Ethanol (wasserfrei denaturiert, histologische Grade 100%, 95%, 80%, 75% und 50%). Verdünnung aus 100% Lagerbestand mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O)
  3. Xylol
  4. IHC-kompatible Glasrutsche, um sicherzustellen, dass der Gewebeabschnitt während des gesamten Verfahrens befestigt bleibt. IHC-kompatible Glasschieber haben eine spezielle Beschichtung und sind bei mehreren Händlern erhältlich. Wenn Sie ICC ausführen, verwenden Sie eine kammergekammerte Folie. Kammerrutschen ermöglichen es, Zellen in den Kammern auszusäen und in den Inkubator zu legen, bis zellennahe an der Rutsche befestigt sind und die richtige Konfluenz erreichen, an der die Kammern entfernt werden können und die Färbung auf die gleiche Weise wie IHC verlaufen kann.
  5. paraffin
  6. 0,3% Wasserstoffperoxid (H2O2)/Methanol: Zur Zubereitung 1 ml 30% H2O2 bis 99 ml Methanol hinzufügen. Bei -20°C lagern
  7. Antigen-Abrufpuffer: IHC-Citratpuffer pH 6,0

Frische gefrorene Abschnitte

  1. Optimale Schnitttemperatur (OCT) Einbettverbindung
  2. Optimale Fixierung: 4% PFA oder Aceton, das auf -20°C abgekühlt wurde

Färbung

  1. Sperrpuffer: Sollte vom Benutzer bestimmt werden. Ein Beispiel ist Pferdeserum in 1X PBS verdünnt
  2. Verdünnter Primärantikörper: siehe Herstellerspezifikationen
  3. Verdünnter biotinylatierter Sekundärantikörper: siehe Herstellerspezifikationen
  4. Verdünnte Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP): Nur zur Peroxidase-Visualisierung. Siehe Herstellerspezifikationen.
  5. DAB oder ein anderes kompatibles Substrat
  6. Counterstain (optional)
  7. Ethanol (wasserfrei denaturiert, histologische Qualität 100% und 95%)
  8. Xylol
  9. Organo/Limonene Mount

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Immunologie. Immunhistochemie und Immunzytochemie: Gewebebildgebung mittels Lichtmikroskopie. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Präparation von Zellen für die Immunzytochemie

  1. Saatzellen von Interesse auf kammerförmigen Dias oder kammerförmigen Decklippen durch Zugabe von 0,5 ml Zellsuspension zu den Brunnen einer 24 Brunnenkulturplatte.
    Hinweis: Einige Zellen können Wachstum auf behandelten Coverlips erfordern, wie z. B. Mit Polylysin behandelte Abdeckungen. Die optimalen Behandlungsbedingungen sollten vom Anwender in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp bestimmt werden.
  2. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37°C bis 50-70% Konflukation wachsen.
  3. Sobald die Zellen eine optimale Koninfluenza erreicht haben, entfernen Sie die Kulturmedien aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 0,5 ml von 4% PFA (in 1X PBS) inkubieren und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS.
  5. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml von 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Den Permeabilisationspuffer absaugen und die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS waschen.
  7. Die Zellen auf Denlips sind nun fixiert und permeabilisiert. Gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunohistochemie Beispiel gezeigt - mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24 Well-Platte statt direkt auf einem Gewebeabschnitt Dia durchgeführt werden sollte.

2. Vorbereitung von Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded-Abschnitten für die Färbung

  1. Erhalten Sie vorbereitete formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeabschnitte.

Deparaffinisierung

  1. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.

Rehydration

  1. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für jeweils 3 min ein.
  2. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 3 min ein.
  3. Tauchen Sie die Dias in 70% Ethanol für 3 min ein.
  4. Tauchen Sie die Dias in 50% Ethanol für 3 min ein.

Blockieren der aktivitäten der endogene Peroxidase

  1. Inkubieren Sie die Dias in 100 ml von 0,3% H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.

Antigen Retrieval

  1. Tauchen Sie die Dias in den IHC-Citratpuffer (pH 6) ein und kochen Sie sie 20 min hoch.
  2. Geweberutschen sind nun zur Färbung bereit.

3. Vorbereitung von frisch gefrorenen, OTC-eingebetteten Abschnitten für die Färbung

  1. Legen Sie 5 mm frisch isoliertes Gewebe in eine Form und fügen Sie OCT hinzu, bis der Abschnitt vollständig abgedeckt ist.
  2. Tauchen Sie den Gewebeblock langsam in flüssigen Stickstoff ein, bis er vollständig eingefroren ist. Die Probe kann nun bis zu einem Jahr bei -80°C gelagert werden.
  3. Sobald sie zum Schnitt bereit sind, übertragen Sie den gefrorenen Gewebeblock in einen Kryostat und lassen Sie das gesamte Setup auf -20°C kommen.
  4. Schneiden Sie 5-10 m dicke Gewebeabschnitte mit einem Kryostat und verwenden Sie Pinsel, um Abschnitte direkt auf IHC-kompatible Glasschlitten zu platzieren.
  5. Lassen Sie Die Dias über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Die Dias können auch bei -80°C gelagert werden.
  6. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur ein, um die Dias vor der Färbung zu fixieren. Die optimale Fixierungsmethode sollte vom Benutzer bestimmt werden.
  7. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
  8. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 0,3%H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur ein, um jede endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
  9. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
  10. Die Dias sind nun zur Färbung bereit.

4. Färbung

  1. Kreisen Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Barrierestift.

Blockieren

  1. Mit einer Pipette 100 l Sperrpuffer (Pferdeserum in 1X PBS verdünnt) - über den Abschnitt für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  2. Entfernen Sie den Blockierpuffer mit einer Pipette.

Primäre Antikörper-Inkubation

  1. Inkubieren Sie das eingekreiste Gewebe mit 100 l verdünnter Primärantikörperlösung (Maus antihumanes Cyclin D1 verdünnt 1:100 im Sperrpuffer) 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min.

Sekundäre Antikörperinkubation

  1. Inkubieren Sie die Probe mit 100 l verdünntem biotinylierten Sekundärantikörper (biotinyliertes Pferd Antimaus-IgG verdünnt 1:200) für 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Entfernen Sie den sekundären Antikörper, indem Sie die Abschnitte abtropfen lassen und mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min waschen.

Farbentwicklung

  1. Visualisierung mit HRP: Add 100 l Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Reagenz und inkubieren die Abschnitte in dunkel in für 30 min bei Raumtemperatur
    Hinweis: Fluoreszierend markierte Antikörper können auch mit einem geeigneten Mikroskop verwendet und visualisiert werden.
  2. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.
  3. Entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 l DAB für bis zu 5 min inkubieren.
  4. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie destilliertes Wasser (dH2O) für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen.

Gegenfärbung (falls gewünscht)

  1. Tauchen Sie die Dias kurz in Harris Hematoxylin Solution (oder 0,5% Methylgrün in 0,1M Natriumacetat (pH 4,2)) für 10 min.
  2. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie rutschen in dH2O zweimal für jeweils 5 min waschen.

austrocknung

  1. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
  2. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
  3. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.
  4. Blot die Dias mit einem Papiertuch.

Montage- und Deckbedeckungsapplikation

  1. Fügen Sie den Dias einen Tropfen Montagemedien wie Organo-Limonene Mount hinzu und legen Sie einen Deckzettel über die Abschnitte.

Mikroskopische Analyse

  1. Beobachten Sie die gebeizten Abschnitte unter einem geeigneten Mikroskop für die Analyse. Hier wurde ein Standard-Lichtmikroskop zur Beobachtung und eine montierte Digitalkamera zur Bildgebung eingesetzt.

Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Detektionssystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position innerhalb der Zellen und Gewebe sowie die relativen Werte zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.

Für die Immunzyztochemie, die speziell Protein- oder Antigenpositionen in Zellen visualisiert, umfasst dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, die die Kultivierung der Zellen in Wachstumsmedien auf einem Decksrutsch oder -schlitten, typischerweise, in den Brunnen einer Kulturplatte beinhaltet. Es folgt eine Fixierung, bei der den Zellen ein ausfällendes oder vernetzbares Mittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Reinigungsmittel hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.

Bei der Gegenmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben visualisiert und die Probenvorbereitung hat fünf Schritte. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, in der Regel mit Paraformaldehyd. Es folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und dann das Schneiden dieses Blocks mit einer Maschine namens Mikrotome, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Dias platziert werden können. Als nächstes werden die Dias einer Deparaffinierung oder Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe unterzogen. Anschließend kann ein optionaler Antigen-Abrufschritt durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Wärme oder Enzymen durchgeführt werden, um Epitope zu entlarven, die während der Fixierung vernetzt wurden, so dass sie für die Antikörperbindung zur Verfügung stehen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zelle oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser primäre Antikörper sollte an das Protein von Interesse binden. Als Nächstes wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet. Dieser sekundäre Antikörper wird mit einem Enzym namens HRP konjugiert oder kann es binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dies in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Dias sind auch mit Hämatoxylin befleckt, das die Kerne blau beschriftet und einen räumlichen Bezugspunkt zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird dem Dia Einbaumedien hinzugefügt, gefolgt von einem Abdeckschlupf, um die gebeizte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Schließlich können die Dias auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.

In diesem Video beobachten Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeabschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeabschnitte.

Zunächst müssen die Zellen von Interesse auf Deckellips sitzen. Dazu legen Sie bei der Arbeit in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckel in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Abdeckungen mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie als Nächstes das UV-Licht aus. Um die von Interesse interessierten Zellen von einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, die Medien anzusaugen, kurz mit PBS zu waschen und trypsin für 2 Minuten in die Zellen zu geben. Tippen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Fügen Sie als Nächstes 0 hinzu. 5 ml der Zellsuspension in jedem Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Abdeckungen abdeckung. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 50-70% konfluent sind.

Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in in. 5 ml 4% Paraformaldehyd in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. Nach dem Entfernen des Fixativs spülen Sie die Zellen 1 ml 1X PBS über jeden Coverslip hinzu. Sofortiges Aspirieren der PBS, dann wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe.

Jetzt, permeablizieren Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,5 ml von 0,1% Triton X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Saugen Sie den Permeabilisierungspuffer ab und spülen Sie die Zellen dann, indem Sie jedem Bohrkörper 1 ml 1X PBS hinzufügen. Sofortiges Absaugen der PBS und wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe. Nun, da die Zellen auf den Decklippen fixiert und permeabilisiert sind, gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunhistochemie-Beispiel mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24-Well-Platte durchgeführt werden sollten und nicht direkt auf einer Gewebesektionsrutsche.

Um zu beginnen, erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte. Entparaffinisieren Sie die Dias, indem Sie sie in ein Diaregal legen und sie dann vollständig in 250 ml 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Dias für 5 Minuten im Xylol brüten. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter für weitere 5 Minuten.

Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Zyklus des Waschens, Trocknens mit einem Papiertuch und der Übertragung der Dias in ein neues Bad nach den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit fort. Nach dem letzten Ethanolwaschen das Gestell mit einem Papiertuch abwischen und die Dias in 100 ml von 0,3 % Wasserstoffperoxid 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, um eine endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischen 1X PBS für weitere 5 Minuten.

Als nächstes führen Sie antigen-retrieval durch, indem Sie die Dias in 250 ml IHC-Citratpuffer bei pH 6,0 eintauchen und 20 Minuten kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.

Um den Färbungsprozess für IHC zu beginnen, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Sperrpuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum in 1X PBS verdünnt wird, über den Abschnitt zu legen. Inkubieren Sie die Dias für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer mit einer Pipette.

Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Sperrpuffer bei einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum in 1X PBS zu einer 1 verdünnt enden. 5 mL Eppendorf-Röhre, gefolgt von 10 Mikrolitern des Primärantikörpers. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Dia, und waschen Sie ihn dann in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS.

Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 ml Schlauch hinzufügen, gefolgt von 5 Mikrolitern des sekundären Antikörpers, der in diesem Fall biotinylierte Seimat-Anti-Maus-IGG ist. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten den sekundären Antikörper entfernen, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Dias dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischen 1X PBS.

Fügen Sie nun 100 Mikroliter Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz hinzu und bebrüten die Abschnitte im Dunkeln 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS eintauchen. Ähnlich wie bei früheren Waschschritten, wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS. Als nächstes entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 Mikroliter DAB für bis zu 5 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser eintauchen.

Jetzt können Dias auf Wunsch gegengefärbt werden. Dazu tauchen Sie die Dias kurz in 250 ml Harris Hematoxylin Solution ein. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Rutschen in 250 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 1 weitere Zeit mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Um dies zu tun, zuerst inkubieren Sie die Dias in 95% Ethanol für 5 Minuten. Die Dias auf ein Papiertuch bumgen und für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95% Ethanol geben. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Blotens mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Lösungen für jeweils 5 Minuten.

Nach der letzten Inkubation die Dias mit einem Papiertuch bedrucken und dann einen Tropfen Montagemedien, wie Organo-Limonene Mount, zu den Dias hinzufügen. Platzieren Sie nun einen Deckelschlupf über die Abschnitte, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzufangen. Die Dias können nun unter dem Mikroskop zur Analyse beobachtet werden.

Um die gebeizten Abschnitte zu beobachten, verwenden Sie ein Standard-Lichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild zu erfassen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wil-Typ und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen zur Untersuchung der Dyclin-D1-Expression bei Lymphomen verglichen. Die Gewebe wurden paraffin-eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exemittierte Zellen werden durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund angezeigt. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so haben die nicht vergrößerten Milzen unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin-D1-Expression. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, die auf eine Korrelation zwischen Krebsentwicklung und Cyclin-D1-Expression in diesem Mausmodell hinweist.

Results

IHC und ICC haben eine breite Palette von Anwendungen. Eine Verwendung von IHC besteht beispielsweise darin, die Expression von Onkogenen in spontanen Mausmodellen der Tumorentwicklung zu untersuchen. In Abbildung 2haben wir festgestellt, ob die Cyclin-D1-Expression in vergrößerten Milz in einem spontanen Mausmodell der Lymphomentwicklung erhöht wurde. Splenic-Gewebeproben wurden in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten, mit einem Anti-Cyclin-D1-Antikörper gebeizt (verdünnt 1:200 im Sperrpuffer), und dann wurden die Abschnitte mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exemittierte Zellen werden durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund angezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Cyclin-D1-Expression in vergrößerten Milz verstärkt wurde, was auf eine Korrelation zwischen der Krebsentwicklung und der Cyclin-D1-Expression in diesem Modell hindeutet.

Figure 2
Abbildung 2: Splenic Cyclin D1 Expression in einem Spontaneous Double Transgenic (DTG) Mausmodell des Lymphoms. Ein Bild von Milzgewebe, das mit einem Anti-Cyclin D1-Primärantikörper gefärbt, mit Methylgrün gegengefärbt und mit einem biotinylierten Sekundärantikörper und ABC-Reagenz visualisiert wird, das mit DAB-Substrat aktiviert wird. Die rötlich-braune Farbe stellt Stellen dar, an denen der Antikörper gebunden ist und auf das Vorhandensein von Cyclin D1 hinweist, die Tumorzellen innerhalb der Struktur des Milzgewebes exemiten, das blau eingefleckt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Applications and Summary

Immunhistochemie (IHC) und Immunzytochemie (ICC) sind Techniken, die verwendet werden, um die Expression und Lokalisierung spezifischer Antigene mit Antikörpern zu visualisieren. Gewebe werden zuerst in dünne Abschnitte geschnitten, die die Gewebemorphologie erhalten, und auf einem Dia platziert. Die Antikörper werden dann hinzugefügt und binden das Antigen von Interesse und sind mit einem spezifischen Tag ausgestattet, mit dem sie unter dem Mikroskop visualisiert werden können. So kann durch dieses Grundkonzept die Verteilung von Antigenen im Kontext der Gewebestruktur visualisiert und untersucht werden. Obwohl das übergreifende Konzept einfach ist, gibt es mehrere verschiedene Ansätze und Variationen, die entwickelt wurden, die sowohl die Komplexität als auch die Nützlichkeit dieser Techniken erhöhen. In diesem Papier wurde das Grundkonzept des IHC und des IStGH, die wichtigsten Entscheidungen, die bei der Anwendung dieser Techniken berücksichtigt werden müssen, sowie ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll behandelt. Die von IHC und ICC produzierten Bilder sind in der Regel das Endprodukt und können veröffentlicht werden, um offensichtliche Unterschiede in den Mengen oder der Verteilung der Färbung zwischen verschiedenen Bedingungen hervorzuheben.

References

  1. Coons, A. H. Creech, H. J., Jones, N. and Berliner, E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 45 (3), 159-170 (1942).
  2. Ripoli, F. L., Mohr, A., Hammer, S. C., Willenbrock, S., Hewicker-Trautwein, M., Hennecke, S., Escobar, H. M. and Nolte, I. A comparison of fresh frozen vs. Formalin-fixed, paraffin-embedded specimens of canine mammary tumors via branched-DNA assay. International Journal of Molecular Sciences, 17 (5) (2016).

1. Präparation von Zellen für die Immunzytochemie

  1. Saatzellen von Interesse auf kammerförmigen Dias oder kammerförmigen Decklippen durch Zugabe von 0,5 ml Zellsuspension zu den Brunnen einer 24 Brunnenkulturplatte.
    Hinweis: Einige Zellen können Wachstum auf behandelten Coverlips erfordern, wie z. B. Mit Polylysin behandelte Abdeckungen. Die optimalen Behandlungsbedingungen sollten vom Anwender in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp bestimmt werden.
  2. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37°C bis 50-70% Konflukation wachsen.
  3. Sobald die Zellen eine optimale Koninfluenza erreicht haben, entfernen Sie die Kulturmedien aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in 0,5 ml von 4% PFA (in 1X PBS) inkubieren und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS.
  5. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml von 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Den Permeabilisationspuffer absaugen und die Brunnen dreimal mit 1 ml 1X PBS waschen.
  7. Die Zellen auf Denlips sind nun fixiert und permeabilisiert. Gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunohistochemie Beispiel gezeigt - mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24 Well-Platte statt direkt auf einem Gewebeabschnitt Dia durchgeführt werden sollte.

2. Vorbereitung von Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded-Abschnitten für die Färbung

  1. Erhalten Sie vorbereitete formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeabschnitte.

Deparaffinisierung

  1. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.

Rehydration

  1. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für jeweils 3 min ein.
  2. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol für 3 min ein.
  3. Tauchen Sie die Dias in 70% Ethanol für 3 min ein.
  4. Tauchen Sie die Dias in 50% Ethanol für 3 min ein.

Blockieren der aktivitäten der endogene Peroxidase

  1. Inkubieren Sie die Dias in 100 ml von 0,3% H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.

Antigen Retrieval

  1. Tauchen Sie die Dias in den IHC-Citratpuffer (pH 6) ein und kochen Sie sie 20 min hoch.
  2. Geweberutschen sind nun zur Färbung bereit.

3. Vorbereitung von frisch gefrorenen, OTC-eingebetteten Abschnitten für die Färbung

  1. Legen Sie 5 mm frisch isoliertes Gewebe in eine Form und fügen Sie OCT hinzu, bis der Abschnitt vollständig abgedeckt ist.
  2. Tauchen Sie den Gewebeblock langsam in flüssigen Stickstoff ein, bis er vollständig eingefroren ist. Die Probe kann nun bis zu einem Jahr bei -80°C gelagert werden.
  3. Sobald sie zum Schnitt bereit sind, übertragen Sie den gefrorenen Gewebeblock in einen Kryostat und lassen Sie das gesamte Setup auf -20°C kommen.
  4. Schneiden Sie 5-10 m dicke Gewebeabschnitte mit einem Kryostat und verwenden Sie Pinsel, um Abschnitte direkt auf IHC-kompatible Glasschlitten zu platzieren.
  5. Lassen Sie Die Dias über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Die Dias können auch bei -80°C gelagert werden.
  6. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur ein, um die Dias vor der Färbung zu fixieren. Die optimale Fixierungsmethode sollte vom Benutzer bestimmt werden.
  7. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
  8. Tauchen Sie die Dias in 250 ml von 0,3%H2O2 für 30 min bei Raumtemperatur ein, um jede endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
  9. Tauchen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS 2 mal für 5 min pro Stück ein.
  10. Die Dias sind nun zur Färbung bereit.

4. Färbung

  1. Kreisen Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Barrierestift.

Blockieren

  1. Mit einer Pipette 100 l Sperrpuffer (Pferdeserum in 1X PBS verdünnt) - über den Abschnitt für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  2. Entfernen Sie den Blockierpuffer mit einer Pipette.

Primäre Antikörper-Inkubation

  1. Inkubieren Sie das eingekreiste Gewebe mit 100 l verdünnter Primärantikörperlösung (Maus antihumanes Cyclin D1 verdünnt 1:100 im Sperrpuffer) 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min.

Sekundäre Antikörperinkubation

  1. Inkubieren Sie die Probe mit 100 l verdünntem biotinylierten Sekundärantikörper (biotinyliertes Pferd Antimaus-IgG verdünnt 1:200) für 30 min bei Raumtemperatur.
  2. Entfernen Sie den sekundären Antikörper, indem Sie die Abschnitte abtropfen lassen und mit 1X PBS 2 mal für jeweils 5 min waschen.

Farbentwicklung

  1. Visualisierung mit HRP: Add 100 l Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Reagenz und inkubieren die Abschnitte in dunkel in für 30 min bei Raumtemperatur
    Hinweis: Fluoreszierend markierte Antikörper können auch mit einem geeigneten Mikroskop verwendet und visualisiert werden.
  2. Waschen Sie die Dias mit 1X PBS 2 mal für je 5 min.
  3. Entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 l DAB für bis zu 5 min inkubieren.
  4. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie destilliertes Wasser (dH2O) für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügen.

Gegenfärbung (falls gewünscht)

  1. Tauchen Sie die Dias kurz in Harris Hematoxylin Solution (oder 0,5% Methylgrün in 0,1M Natriumacetat (pH 4,2)) für 10 min.
  2. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie rutschen in dH2O zweimal für jeweils 5 min waschen.

austrocknung

  1. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
  2. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol 2 mal für 5 min jeder.
  3. Tauchen Sie die Dias in 100% Xylol 2 mal für 5 min jeder.
  4. Blot die Dias mit einem Papiertuch.

Montage- und Deckbedeckungsapplikation

  1. Fügen Sie den Dias einen Tropfen Montagemedien wie Organo-Limonene Mount hinzu und legen Sie einen Deckzettel über die Abschnitte.

Mikroskopische Analyse

  1. Beobachten Sie die gebeizten Abschnitte unter einem geeigneten Mikroskop für die Analyse. Hier wurde ein Standard-Lichtmikroskop zur Beobachtung und eine montierte Digitalkamera zur Bildgebung eingesetzt.

Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Detektionssystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position innerhalb der Zellen und Gewebe sowie die relativen Werte zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.

Für die Immunzyztochemie, die speziell Protein- oder Antigenpositionen in Zellen visualisiert, umfasst dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, die die Kultivierung der Zellen in Wachstumsmedien auf einem Decksrutsch oder -schlitten, typischerweise, in den Brunnen einer Kulturplatte beinhaltet. Es folgt eine Fixierung, bei der den Zellen ein ausfällendes oder vernetzbares Mittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Reinigungsmittel hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.

Bei der Gegenmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben visualisiert und die Probenvorbereitung hat fünf Schritte. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, in der Regel mit Paraformaldehyd. Es folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und dann das Schneiden dieses Blocks mit einer Maschine namens Mikrotome, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Dias platziert werden können. Als nächstes werden die Dias einer Deparaffinierung oder Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe unterzogen. Anschließend kann ein optionaler Antigen-Abrufschritt durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Wärme oder Enzymen durchgeführt werden, um Epitope zu entlarven, die während der Fixierung vernetzt wurden, so dass sie für die Antikörperbindung zur Verfügung stehen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zelle oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser primäre Antikörper sollte an das Protein von Interesse binden. Als Nächstes wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet. Dieser sekundäre Antikörper wird mit einem Enzym namens HRP konjugiert oder kann es binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dies in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Dias sind auch mit Hämatoxylin befleckt, das die Kerne blau beschriftet und einen räumlichen Bezugspunkt zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird dem Dia Einbaumedien hinzugefügt, gefolgt von einem Abdeckschlupf, um die gebeizte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Schließlich können die Dias auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.

In diesem Video beobachten Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeabschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeabschnitte.

Zunächst müssen die Zellen von Interesse auf Deckellips sitzen. Dazu legen Sie bei der Arbeit in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckel in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Abdeckungen mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie als Nächstes das UV-Licht aus. Um die von Interesse interessierten Zellen von einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, die Medien anzusaugen, kurz mit PBS zu waschen und trypsin für 2 Minuten in die Zellen zu geben. Tippen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Fügen Sie als Nächstes 0 hinzu. 5 ml der Zellsuspension in jedem Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Abdeckungen abdeckung. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 50-70% konfluent sind.

Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in in. 5 ml 4% Paraformaldehyd in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. Nach dem Entfernen des Fixativs spülen Sie die Zellen 1 ml 1X PBS über jeden Coverslip hinzu. Sofortiges Aspirieren der PBS, dann wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe.

Jetzt, permeablizieren Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,5 ml von 0,1% Triton X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Saugen Sie den Permeabilisierungspuffer ab und spülen Sie die Zellen dann, indem Sie jedem Bohrkörper 1 ml 1X PBS hinzufügen. Sofortiges Absaugen der PBS und wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe. Nun, da die Zellen auf den Decklippen fixiert und permeabilisiert sind, gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunhistochemie-Beispiel mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24-Well-Platte durchgeführt werden sollten und nicht direkt auf einer Gewebesektionsrutsche.

Um zu beginnen, erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte. Entparaffinisieren Sie die Dias, indem Sie sie in ein Diaregal legen und sie dann vollständig in 250 ml 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Dias für 5 Minuten im Xylol brüten. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter für weitere 5 Minuten.

Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Zyklus des Waschens, Trocknens mit einem Papiertuch und der Übertragung der Dias in ein neues Bad nach den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit fort. Nach dem letzten Ethanolwaschen das Gestell mit einem Papiertuch abwischen und die Dias in 100 ml von 0,3 % Wasserstoffperoxid 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, um eine endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischen 1X PBS für weitere 5 Minuten.

Als nächstes führen Sie antigen-retrieval durch, indem Sie die Dias in 250 ml IHC-Citratpuffer bei pH 6,0 eintauchen und 20 Minuten kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.

Um den Färbungsprozess für IHC zu beginnen, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Sperrpuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum in 1X PBS verdünnt wird, über den Abschnitt zu legen. Inkubieren Sie die Dias für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer mit einer Pipette.

Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Sperrpuffer bei einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum in 1X PBS zu einer 1 verdünnt enden. 5 mL Eppendorf-Röhre, gefolgt von 10 Mikrolitern des Primärantikörpers. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Dia, und waschen Sie ihn dann in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS.

Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 ml Schlauch hinzufügen, gefolgt von 5 Mikrolitern des sekundären Antikörpers, der in diesem Fall biotinylierte Seimat-Anti-Maus-IGG ist. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten den sekundären Antikörper entfernen, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Dias dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischen 1X PBS.

Fügen Sie nun 100 Mikroliter Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz hinzu und bebrüten die Abschnitte im Dunkeln 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS eintauchen. Ähnlich wie bei früheren Waschschritten, wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS. Als nächstes entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 Mikroliter DAB für bis zu 5 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser eintauchen.

Jetzt können Dias auf Wunsch gegengefärbt werden. Dazu tauchen Sie die Dias kurz in 250 ml Harris Hematoxylin Solution ein. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Rutschen in 250 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 1 weitere Zeit mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Um dies zu tun, zuerst inkubieren Sie die Dias in 95% Ethanol für 5 Minuten. Die Dias auf ein Papiertuch bumgen und für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95% Ethanol geben. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Blotens mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Lösungen für jeweils 5 Minuten.

Nach der letzten Inkubation die Dias mit einem Papiertuch bedrucken und dann einen Tropfen Montagemedien, wie Organo-Limonene Mount, zu den Dias hinzufügen. Platzieren Sie nun einen Deckelschlupf über die Abschnitte, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzufangen. Die Dias können nun unter dem Mikroskop zur Analyse beobachtet werden.

Um die gebeizten Abschnitte zu beobachten, verwenden Sie ein Standard-Lichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild zu erfassen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wil-Typ und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen zur Untersuchung der Dyclin-D1-Expression bei Lymphomen verglichen. Die Gewebe wurden paraffin-eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exemittierte Zellen werden durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund angezeigt. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so haben die nicht vergrößerten Milzen unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin-D1-Expression. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, die auf eine Korrelation zwischen Krebsentwicklung und Cyclin-D1-Expression in diesem Mausmodell hinweist.

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

RECOMMEND JoVE