Immunprecipitation-basierte Techniken: Reinigung endogener Proteine mit Agarose-Perlen

Immunpräzipitation, oder IP, ist eine weit verbreitete Technik, um ein Protein von Interesse aus einer Zelle oder Gewebelysat oder einer Körperflüssigkeit zur Proteincharakterisierung zu isolieren oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Der Prozess beginnt mit einem Antikörper, der eine hohe Affinität und Spezifität für das Zielprotein hat. Dieser Antikörper wird mit der Probe gemischt, so dass sich Antikörper-Ziel-Komplexe bilden können. Jedes Protein, das an das Zielprotein gebunden ist, wird dabei auch indirekt an den Antikörper gebunden. Als nächstes wird die Lösung mit Agaroseperlen inkubiert, die zu einem bakteriellen Protein konjugiert sind, das eine starke Affinität zur konstanten Region der Antikörper hat. Das bakterielle Protein bindet an den Antikörper und verbindet die Antikörper-Ziel-Komplexe mit den Perlen. Dann wird die Lösung zentrifugiert, um die Perlen auszufällen, wodurch der gesamte Komplex extrahiert wird, der den bindungden Antikörper, das Zielprotein und alle interagierenden Proteine enthält. Schließlich werden die gebundenen Proteine aus den Perlen extrahiert und voneinander freigesetzt und für die weitere Analyse durch Techniken wie Western Blotting verwendet.

Mehrere Variationen verschiedener Teile dieser Technik werden häufig verwendet, wie Z. B. Pre-Clearing, mit Peptid-Tags oder magnetischen Perlen oder die Analyse anderer Nicht-Protein-Bindungspartner. IP kann durch einen Pre-Clearing-Schritt vorangegeben werden, um unspezifische Antikörper-bindende Proteine in der Probe zu entfernen und den Hintergrund zu minimieren. Dabei wird die Probe zunächst mit Isotypkontrollantikörpern inkubiert, so dass sie sich an diese Proteine binden können, und dann mit Agaroseperlen die Komplexe ausgefällt. Das Beispiel ist dann bereit, mit der tatsächlichen IP fortzufahren.

Peptid-Tags sind nützlich, wenn ein bestimmter Antikörper für IP nicht verfügbar ist. Hier kann das Zielprotein genetisch verändert werden, um ein Peptid-Epitop-Tag zu enthalten, und ein Antikörper gegen das Tag ist in der Lage, das Protein von Interesse herauszuziehen. Magnetperlen werden oft anstelle von Agarose verwendet, um das Ziel zu fällen. Nach der Bindung an den Antikörper-Ziel-Komplex wird das Probenröhrchen in ein starkes Magnetfeld gelegt, das die Perlen aus der Lösung extrahiert. Dies eliminiert die Notwendigkeit der Zentrifugation und verbessert Geschwindigkeit und Komfort.

Immunpräzipitation wird auch zur Untersuchung von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen verwendet und sind als Chromatin-Immunpräzipitation bzw. RNA-Immunpräzipitation bekannt. Diese Variationen sind nützlich für die Fehlerbehebung und Anpassung der Methode für verschiedene experimentelle Anwendungen. In diesem Video werden Sie beobachten, wie man eine Zelle lysiert und Immunpräzipitation durchführt, um ein Protein von Interesse zu extrahieren, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse, um das Experiment zu validieren.

Um zu beginnen, legen Sie die vorgesammelten Zellen in eine Mikrozentrifuge und drehen Sie bei 13 Tausend U/min für drei Minuten. Entfernen Sie nach dem Spin den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 MikroliterLysis-Puffer RIPA mit PMSF wieder aus. Nun, stören Sie die Zellen mit ein paar schnellen Impulsen mit einem Wirbel und dann das Lysat ein paar Mal mit einer 25-Meter-Nadel an einer Spritze befestigt, wobei darauf zu achten, dass Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Zellen für 15 Minuten auf Eis. Nach dem Inkubieren der Proben auf Eis zentrieren Sie das Lysat für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Beschriften Sie ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Nach der Drehung den Überstand auf das frisch beschriftete Rohr übertragen und das Pellet entsorgen. Als nächstes vorab das Lysat von Verunreinigungen, die nicht spezifisch an die Agaroseperlen oder den primärantikörper binden, durch Zugabe von 20 Mikrolitern der Protein A/G PLUS-Agarose-Perlen und ein Mikrogramm eines Isotyp-Kontrollantikörpers an das Lysat, das in diesem Beispiel ist eine Maus-IgG1-Isotypsteuerung. Inkubieren Sie das Rohr auf einem Rotator in einem kalten Raum für 30 Minuten. Nachdem Sie das Lysat im Kalten Raum 30 Minuten lang rotiert haben, zentrieren Sie die Probe 30 Sekunden lang bei 4 Grad Celsius bei 3200 U/min. Entfernen Sie das Rohr aus der Zentrifuge und übertragen Sie den vorgereinigten Überstand in ein frisch beschriftetes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Entsorgen Sie das Pellet.

Bestimmen Sie nun die Proteinkonzentration der Zelle lysieren, indem Sie einen Bradford-Assay durchführen. Etikett sieben 1. 5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eins bis sechs und Proben und Aliquot 1000 Mikroliter des Bradford-Reagenzes in jede Röhre. Sechs der Rohre werden verwendet, um eine Standardkurve zu machen, indem verschiedene Mengen bekannter Mengen von BSA zu jedem Rohr hinzugefügt werden. Die hinzuzufügenden Beträge sind in dieser Tabelle aufgeführt. Im siebten Probenröhrchen einen Mikroliter des vorgereinigten Lysats hinzufügen. Legen Sie 200 Mikroliter aus jedem der sieben Röhren in einzelne Brunnen einer flachen 96-Well-Platte und wiederholen Sie jede Probe in Dreifacharbeit, so dass es drei Spalten mit sieben Proben gibt. Lesen Sie die Platte auf einem Plattenleser mit einer Wellenlänge von 595 Nanometern. Nach dem Erstellen einer Standardkurve in Excel berechnen Sie die Proteinkonzentration des vorgereinigten Lysats.

Als nächstes beschriften Sie zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugen-Röhren - eine als Kontrolle und die andere als Test, die in diesem Beispiel der c-myc-Antikörper sein wird. Legen Sie 500 Mikrogramm des vorgereinigten Lysats in jedes dieser Rohre und bringen Sie dann das Gesamtvolumen für jedes Rohr mit Lysepuffer auf bis zu 500 Mikroliter. Als nächstes fügen Sie dem Testgruppenröhrchen zwei Mikrogramm des Anti-C-Myc-Antikörpers hinzu. Fügen Sie für die Steuerung zwei Mikrogramm des IgG1-Isotyp-Kontrollantikörpers der Maus hinzu. Sobald die Antikörper in die Rohre gegeben sind, legen Sie die Proben auf einen Rotator in einem kalten Raum und inkubieren Sie für zwei Stunden. Nun fügen Sie die Agarose Perlen. Dazu wird empfohlen, das Ende einer Pipettenspitze abzuschneiden und dann mit dieser modifizierten Spitze 200 Mikroliter der Protein A/G PLUS-Agarose-Perlen in jedes Rohr einzutragen. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Rotator im Kühlraum über Nacht.

Nach der Inkubation entfernen Sie die Rohre aus dem Rotator und drehen Sie die Lysate in der Mikrozentrifuge, um die Perlen herunterzuziehen. Nachdem die Drehung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und aspirieren Sie den Überstand aus jedem Rohr. Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 500 Mikrolitern von 1X Dulbecco PBS. Die Rohre in eine Mikrozentrifuge geben und 30 Sekunden bei vier Grad Celsius nach unten drehen. Entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugenschritte noch einmal für insgesamt zwei Mal. Entfernen Sie die Rohre aus der Mikrozentrifuge und aspirieren Sie den Puffer aus jedem Rohr. Entfernen Sie mit Gel-Ladespitzen den restverlassenen Puffer von den Perlen und halten Sie die Perlen auf Eis, um das gebundene Protein zu vereitten.

In diesem Beispiel wird das Protein in SDS-PAGE-Laufpuffer eluiert, indem es für die Western Blot-Analyse kocht. Um dies zu tun, setzen Sie die Perlen in 20 Mikroliter SDS-PAGE Ladefarbstoff mit Beta-Mercaptoethanol, oder BME. Kochen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, um die Immunokomplexe von den Perlen zu trennen. Dann zentrifugieren Sie die Perlen mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Mikrozentrifuge und halten Sie sie bei Raumtemperatur in einem Rack. Mit Gel-Ladespitzen die Proben sorgfältig aus den Perlen pipetten und in Brunnen eines 4 bis 15% Gradienten SDS-PAGE Gel sladen. Laden Sie zusätzlich zu den Proben eine Fahrspur mit einer Proteinleiter sowie eine Fahrspur mit dem vorgereinigten Lysat als Ladekontrolle. Sobald das Gel geladen ist, führen Sie das Gel bei 100 Volt aus.

Nachdem die Färbefront den Boden des Gels erreicht hat, was etwa eine Stunde dauern sollte, stoppen Sie das Gel und machen Sie ein Western Blot Sandwich, um sicherzustellen, dass die PVDF-Membran zwischen dem Gel und der Kathode liegt. Legen Sie das Western Blot Sandwich in das Transfergerät und übertragen Sie die Proteine auf dem Gel für eine Stunde bei 100 Volt auf die Membran. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in fünf Milliliter Block, um zu verhindern, dass die Antikörper nicht spezifisch an die Membran binden. Gestein bei niedriger Einstellung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie den Blockierenden Puffer. Fügen Sie fünf Milliliter des Sperrpuffers mit dem Detektionsantikörper in die Membran ein. Hier wird ein Anti-c-Myk-Antikörper verwendet, der sich von dem für den Pull down verwendeten unterscheidet.

Inkubieren Sie den Fleck über Nacht, bei vier Grad Celsius auf einer Wippe in einer niedrigen Umgebung. Entfernen Sie nach der Inkubation den Antikörper und den Blockierpuffer. Waschen Sie den Fleck, mit fünf Milliliter TBST für fünf Minuten bei Raumtemperatur, auf einer Wippe bei einer niedrigen Einstellung. Dieser Waschschritt sollte zwei- bis fünfmal für insgesamt drei bis sechs Waschungen wiederholt werden, wobei für jede Wäsche frisches TBST verwendet wird. Fügen Sie dem Blot fünf Milliliter eines bis 1000 sekundären Antikörpers und einen Blockierpuffer hinzu. In diesem Fall ist der sekundäre Antikörper HRP-markierte Anti-Kaninchen-Lichtkette. Inkubieren Sie den Fleck auf einer Wippe in einer niedrigen Einstellung für eine unsere bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie den Puffer und waschen Sie den Fleck mit fünf Millilitern TBST. Inkubieren Sie diese Wäsche auf einer Wippe bei niedriger Einstellung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diese Wäsche für insgesamt sechs bis zwölf Wäschen, jede mit frischen fünf Millilitern TBST. Entfernen Sie die endende Wäsche, indem Sie zuerst die Flüssigkeit aus dem Fleck gießen. Dann, mit Pinzette, tab die Kante des Flecks auf einem Labortuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann legen Sie den Fleck in einem frischen Behälter. Als nächstes den Fleck mit 1X Chemiluminescent Detection Reagenz bedecken und eine Minute lang inkubieren.

Arbeiten Sie schnell, tupmpfen Sie den Rand des Flecks auf einem Labortuch, um überschüssiges Detektionsreagenz zu entfernen, und legen Sie den Fleck dann auf die bildgebende Oberfläche des Imager-Trays. Bild mit dem Chemiluminescent-Programm, um mehrere Zeitpunkte von 10 bis 30 Sekunden zu erfassen. Nachdem der Blot abgebildet wurde, wählen Sie ein Bild mit optimaler Bandsichtbarkeit aus, und exportieren Sie dann dieses Bild. Verwenden Sie vor dem Verschieben des Blots den Imager, um ein Bild des Blots zu machen, um die Position der Leiter zu erfassen. Exportieren Sie dann auch dieses Bild. Schließlich richten Sie mithilfe einer Folienvorbereitungssoftware, z. B. PowerPoint, die Bänder und Leiterbilder zu einem Bild aus.

Dieses Bild zeigt das Western Blot-Ergebnis für die Immunpräzipitation des Proteins c-myc aus Thymosexzellen. Von links nach rechts stellen die Fahrspuren die Isotype-Steuerung, die c-myc IP und die vorgeräumte Lysat-Eingabe dar. Die Spur auf der extremen Rechten ist ein zusammengeführtes Bild der Molekulargewichtsleiter. Das starke Band, bei etwa 25 Kilodaltonen, stammt aus der Leichten Kette und das bei 50 Kilodaltonen aus der schweren Kette des Bindungsantikörpers und ist unspezifisch für die IP oder die Proben. C-myc läuft um 67 Kilodalton auf Western Blots und ist in der Regel knapp unterhalb des 75 Kilodalton Leiterbandes sichtbar. In diesem Blot ist das c-myc-Band in der zweiten Spur sichtbar, fehlt aber in der ersten Spur, was darauf hinweist, dass der IP-Antikörper c-myc erfolgreich heruntergezogen hat. Es gibt kein sichtbares Band in der vorgereinigten Lysat-Spur, was darauf hindeutet, dass dieses Protein niedrige endogene Expressionswerte hat.