細胞死に対するアッセイ:細胞毒性能のクロム放出アッセイ

Immunology

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Concepts

ソース: フランシス V. シャアスタッド1,2, ホイットニー・スワンソン2,3,トーマス・S・グリフィス1,2,3,4
1ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
2ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455
3ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455
4ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455

免疫系の細胞の主な機能の一つは、ウイルスに感染しているか、腫瘍細胞に変換を受けた標的細胞を除去することです。免疫細胞の細胞傷害性を測定するためのインビトロアッセイは、長年にわたり実験室で定番となっています。これらのアッセイは、T細胞、NK細胞、または抗原特異的または非特異的な方法で標的細胞を殺す他の免疫細胞の能力を決定するために使用されている。死のリガンド(例えば、ファスリガンドまたはTRAIL)、サイトカイン(例えば、IFNgまたはTNF)、または細胞傷害性顆粒(すなわち、フェクター細胞によって発現されるペロフィン/グランザイムB)は、標的細胞死を誘発することができるいくつかの方法である。近年の腫瘍免疫療法研究の爆発的な増加に伴い、患者の転帰を改善するために免疫細胞の細胞傷害活性を高める薬剤を見つけることに関心が高まっています。逆に、一部の疾患は、免疫細胞細胞傷害活性の過度の活性によって顕著であり、その結果、これらの応答を緩和する薬剤を同定する努力をもたらす。したがって、ユーザーが任意の数の異なるエフェクター細胞、標的細胞、および/または応答修飾子を実験設計に容易に統合できるアッセイを有することは、エフェクター細胞および/の細胞傷害性を迅速に評価する貴重な手段として役立つことができる。またはターゲット セルの応答性。

これらのインビトロアッセイは、異なる細胞集団の混合を含むだけでなく、エフェクターおよび標的細胞の両方の比較的少ない数を使用する。したがって、アッセイの必要性の1つは、標的細胞を容易に検出および定量することができる方法で標識し、ユーザがエフェクター細胞によって媒介される「比的なリシスのパーセント」を決定できるようにすることである。放射能-特に、Na2 51 CrO4の形態のクロム51(51Cr)は、標的細胞内の細胞タンパク質を迅速かつ非特異的に標識する安価な方法である(1)。短い標識および総アッセイ時間は、標的細胞の数および/または表現型の有意な変化の可能性を減少させ、アッセイの結果に影響を与える可能性がある。エフェクター細胞の細胞傷害活性の結果として標的細胞の膜完全性が失われた場合、標的細胞内の51Cr標識細胞タンパク質が培養上清に放出され、定量。インビトロでの免疫細胞の機能を調べるアッセイと同様に、実験の性能向上を考慮すべき重要な考慮事項が数多くあります。最も重要な特徴の1つは、健康なエフェクター(最大細胞傷害活性のために)および標的(最大応答性および最小限の自発的死/51Cr放出)細胞を使用することである。エフェクターと標的細胞接触が必要である(細胞接触を促進するために丸底96ウェルプレートの一般的な使用につながる)(2)。最後に、データ分析は、正および負の制御ターゲット細胞集団を含めることに依存します。

以下のプロトコルは、Europiumを用いて非放射性バージョンが最近開発されたが、エフェクター細胞の集団の細胞傷害性を測定するための標準的な51Cr放出アッセイを行うための手順を概説する。51名Crは強力なγ放射エミッタです。したがって、このアッセイの使用には、適切な放射線安全訓練、専用の実験室スペース、ガンマカウンター、および放射性サンプルの処分が必要です。

このアッセイにおけるイベントの一般的なシーケンスは次のとおりです: 1) 51Cr ラベル付きターゲットを準備します。2)エフェクターセルを準備し、ターゲット細胞が標識している間にプレートに追加します。3)プレートにラベル付きターゲットを追加します。4)インキュベートプレート;5)上清を収穫;6)カウンターでサンプルを実行した後にデータを分析します。サンプルは一般的に三つ編みで調製され、微妙なピペッティングの違いを考慮して平均化されます。

適切なPPEは、このアッセイのために重要です。具体的には、ユーザーはラボコートと手袋を着用する必要があります。研究室や施設に基づき、安全メガネが必要となる場合があります。すべてのステップの間に安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護があるべきである。最後に、51Crを使用するための専用のラボスペースと機器が確保され、51Crのサンプルがどこに保管されているかを示す適切なサイネージと、可能な限りスペースを調査するためのガンマプローブを装備したガイガーカウンターが必要です。汚染。

本研究室では、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)、(CpG刺激対非刺激)が黒色腫細胞を殺す能力を決定し、ヒト黒色腫細胞株WM793をモデル化し、クロム放出アッセイを用いて行う。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 免疫 学. 細胞死に対するアッセイ:細胞毒性能のクロム放出アッセイ. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

手順の概要

細胞死を測定するための典型的な51Cr放出アッセイには、次の手順が含まれます。

  1. まず、標的細胞にNa2[51Cr]O4で標識される。これは、アッセイ中のエフェクター細胞と区別する。
  2. 標的細胞が標識している間に、エフェクター細胞が集められ、シリアル希釈技術を用いて、エフェクター細胞の減少滴定が丸底96ウェルアッセイプレートに生成される。
  3. 標的細胞標識の終わりに、細胞が最初に洗浄され、次に一連のエフェクター細胞希釈を既に含むアッセイプレートに一定数の細胞が追加されます。
  4. 次に、標的エフェクター細胞ミックスを一定期間インキュベートし、標的細胞との十分な細胞相互作用を可能にし、細胞リシスを媒介する。
  5. 最後に、培養上清を採取し、チューブに集化する。51Cr量は、ガンマカウンタを用いて定量される。
  6. 最後に、データが収集され、ターゲット細胞の「パーセンテージ特定細胞リシス」を計算するために使用されます。

1. 51Crでターゲットセルを標識する

  1. 開始するには、標的細胞を、(ここでヒト黒色腫細胞株WM793)を、単一細胞懸濁液に調製する。
  2. これを行うには、まず組織培養フラスコから培中を取り除きます。
  3. 次いで、1X PBSの5mLで細胞を洗浄する。
  4. プレートに1mLのトリプシンを2分間添加して細胞をトリプシン化する。
  5. フラスコを軽くタップして、フラスコ表面からセルを緩めます。
  6. フラスコに 5 mL の RPMI メディアを追加し、メディアを上下にピプテしてセルを取り外します。
  7. セル懸濁液を15mLの円錐管に集め、1200rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離します。上清をデカント。
  8. ペレットに10mLのメディアを追加し、メディアを上下に優しくピプテリングして細胞を懸濁液に入します。
  9. 血球計を用いて細胞濃度を決定する。
  10. 1x106セルを新しい15 mL円錐管に移します。
  11. 1200 rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清をデカントする。
  12. 簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。
  13. 51 Crの100μCiをWM793ターゲット細胞懸濁液に直接追加します。
    注:特定の放射能に専用のラボスペースを設置する必要があります。さらに、すべてのステップの間に51Crの安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護および51Crが付いているサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも必要です。
  14. チューブに小さな放射性テープを追加して、チューブが放射性であることを示します。
  15. リードシールドを使用してチューブを37°Cのインキュベーターに入れ、1時間インキュベートして15~20分ごとにチューブをフリックし、クロムの標的細胞取り込み量を増やします。
  16. インキュベーション期間の後、5mLのFBSで標的細胞を洗浄し、余分な51Crを除去する。
  17. 1200rpmで細胞を5分間遠心分離し、放射性FBSを適切な廃棄物容器に洗浄します。
  18. ペレットを再度中断し、FBSでもう一度洗います。ガイガーカウンターを使用して、組み込まれた放射能のペレットを確認してください。
  19. ペレットを10mL完全培地で再ステージングし、105セル/mLの細胞濃度を達成した。
    注:51Cr標識後の細胞計数ステップは、安全上の理由からここで大きく省略されている。WM793細胞濃度は、51Cr標識以前と同じであると仮定することができる。

2. エフェクターセルの準備

  1. 様々なエフェクター細胞を用いることができるのは、ヒトまたはマウスT細胞およびNK細胞などである。この例では、PBMCは、標準密度勾配遠心分離(5x106の濃度)によって全血から単離され、使用された。
  2. まず、96ウェルの丸底プレートの行の1つのウェル(ここでは行A、表1を参照)に100 μLの組織培養培地を追加します。ここでは、エフェクター細胞は追加されなく、標的細胞からの「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」として機能します。

Figure 1
表1:51Cr放出アッセイレイアウト:行A-標的細胞(104細胞/100μL)を媒体のみでインキュベートした(「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」を生成する)。異なるエフェクタを含む行B から C ウェル:ターゲット セル (E:T) 比(50:1 ~ 1.5:1) 。行H-標的細胞(104細胞/100μL)を1%NP-40でインキュベート(NP-40は標的細胞をlyss)し、「最大または合計51Cr放出」を生成する。すべてのE:T比は、すべての実験条件に対して三重で試験される。列1-3-非刺激 PBMC およびカラム4-6- CpG 刺激 PBMC。

  1. 次に、PBMCの2Xシリアル細胞希釈(各実験条件に対して三重に)を生成し、5x10 5〜15,625細胞/100μLの培ブレン(ここではB~G行)のエフェクター細胞濃度を得る。
    注:この例では、開始エフェクタ:ターゲットセル(E:T)比は50:1です。ただし、この比率は実験の詳細に応じて調整できます。
  2. これらのウェルにエフェクターセルを追加しないことで、最後の行を空のままにしておきます(ここでは行H)。(この行は、「合計カウント/分、または (c. p. m)」または「最大51Cr リリース」を生成するために使用されます。
  3. ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。

3. アッセイに51Cr標識WM793ターゲットセルを追加する

  1. インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5mLのFBSで洗浄し、余分な51Crを除去する。
  2. 指定された遠心分離機を使用して、1200 rpmで5分間細胞を遠心分離する。
  3. FBS洗浄(放射性上清)を適切な廃棄物容器に取り出します。
  4. FBSの新鮮な5 mLでペレットを再中断することによって洗浄工程を繰り返します。
  5. 細胞を1200 rpmで5分間遠心分離します。
  6. 最後に、ペレットを10mLの完全培地で再中断する。
  7. 51CrラベルWM793細胞懸濁液(105セル/mL)を使い捨て試薬貯蔵所に注ぎます。
  8. 次いで、これらの標識標的細胞の100μLを、96ウェルエフェクター細胞板の各ウェルに、マルチチャネルピペットを用いて加える。
  9. 次に、エフェクター細胞を欠いている井戸の列に1%NP-40(水中)の100 μLを加えます(ここでは行H)。1% NP-40は標的細胞をlyseし、したがって、これらのウェルは、「合計カウント/分、または(c.p.m)」または最大51Cr放出を決定するためのコントロールとして機能します。
  10. プレートの両側にガス透過性テープの小片を追加してプレートに蓋を固定し、51Crが含まれていることを示すために蓋に放射性テープの一部を置きます。
  11. 簡単に言えば、1200 rpmでプレートを遠心分離します。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。
    注:放射性サンプルを取り扱うには、遠心分離機を使用することが重要です。
  12. 遠心分離機からプレートを取り出します。
  13. プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、プレートの上に小さな鉛シールドを施し、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞リシスを可能にする。
    注:インキュベーション期間は、使用されるエフェクター細胞および使用される殺戮の潜在的なメカニズムに応じて4〜18時間に変化しうる。

4. 上清の収穫

  1. インキュベーション期間の終わりには、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。
  2. 次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。これにより、無細胞の上清のコレクションが保証されます。
  3. 今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。
  4. 約10秒後、綿栓の圧力を解放し、綿のプラグをチューブストリップに移します。
  5. これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。
  6. 最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出される51Crの量を定量するためにサンプルを実行します。サンプルは通常1分間測定され、「カウント/分」を容易に決定することができます。
  7. 慎重に、チューブがカウンターにロードされた順序を記録します。

5. データ分析

  1. ここでは、最初の3列に非刺激PBMCを追加し、CpG刺激型PBMC(CpG ODN、24時間(1μg/mL))をカラム4-6に添加した。表 2 を参照してください。
1 2 3 4 5 6 7 8
A 1251 1157 1086 917 1118 1140
B 1832 1986 1971 7629 7913 8180
C 1677 1739 1428 5454 5055 5268
D 1638 1552 1734 4239 3582 3786
E 1658 1580 1339 2818 2623 2750
F 1579 1472 1483 2028 1779 1769
G 1326 1325 1184 1801 1654 1565
H 9220 9367 8067 8774 9647 8236
A1,A2,A3の平均 1164.67 自発的な午後 1058.33
J 平均 B1,B2,B3 -> 1929.67 9.91% 7907.33 87.50% 50:1
K C1,C2,C3の平均 1614.67 5.83% 5259 53.67% 25:1
L D1,D2,D3の平均 1641.33 6.17% 3869 35.91% 12.5:1
M E1,E2,E3の平均 1525.67 4.68% 2730.33 21.36% 6.25:1
N F1,F2,F3の平均 1511.33 4.49% 1858.67 10.22% 3.12:1
O G1,G2,G3の平均 1278.33 1.47% 1673.33 7.86% 1.56:1
P H1,H2,H3の平均 8884.67 最大 c.p.m 8885.67
アンスティム PBMC CpG-スティム PBMC E:T比

表 2: 51Cr リリースアッセイ データ:'1 分あたりのカウント' / 'c. p. m' データ値、平均 c. p. m 値、および計算されたパーセント特定の lysis 値。

  1. 収集されたデータ(1分あたりのカウント、すなわちc.p.m)は、サンプルが元のプレートにレイアウトされたのと同じ方法でスプレッドシートのセルに入力されました。
  2. まず、三位一体の平均を算出した。表2-細胞I3〜P3、非刺激PBMCおよび細胞I6~P6について、CpG刺激PBMCについて。
  3. 平均が決定されると、各条件に対する特定のリシスの割合は、以下の式を使用して計算された。

  4. 特定のリシスの割合は、各条件について計算した(表2 -細胞J4からO4、未刺激PBMCおよびJ7からO7、非刺激PBMCについて)。

このビデオでは、クロム放出アッセイを実行し、エフェクター細胞の細胞毒性電位を決定する方法を観察します。

免疫細胞は、がんやウイルスに感染した細胞などの潜在的に有害な細胞を体から同定し、除去する役割を担っています。T細胞やNK細胞のようないくつかの免疫細胞は、細胞傷害性電位として知られている性質を有し、標的細胞を同定し、タンパク質の分解、リシス、およびそれらの標的細胞の死を誘発するタンパク質を分泌する能力である。細胞傷害性の定量化は、免疫細胞の活性化と効力を測定するために重要であり、クロム放出アッセイは、この目的のために一般的に使用されます。

この方法は、ユーザーが異なる条件下で特定の種類の免疫細胞によって誘発されるシキシック度を比較することを可能にし、癌免疫療法および免疫関連疾患の研究に有益である。まず、標的細胞は、癌細胞と同様に、細胞によって取り込まれる放射性同位元素、クロム51でインキュベートされる。次に、これらの無線標識細胞は、目的の単離された免疫細胞と共培養され、エフェクター細胞とも呼ばれ、丸底に、96-ウェルプレートで2つの細胞型間の相互作用を容易にする。

アッセイの全体的なセットアップは、適切なコントロールと共に、免疫細胞の異なる濃度を有する特定の数の標的細胞をインキュベートすることを含む。この共培養により、エフェクター細胞は標的細胞にアポトーシスおよび溶解を誘導し、その結果、細胞内クロム51を上清中に放出する。次に、あらかじめ最適化された時点で、放出されたクロムを含む上清が全てのウェルから採取される。クロム51は、放射性である、自発的にガンマ放射線を放出するために放射性崩壊を受ける。アッセイプレート内のすべてのウェルからの上清中のガンマ放射線レベルは、標的細胞のリシスの定量可能な出力を表す。これはガンマカウンターを使用して測定され、免疫細胞の細胞毒性電位を決定するために使用されます。

まず、標的細胞は、この例ではヒト黒色腫細胞株WM793を、単一細胞懸濁液に調製する。これを行うには、まず組織培養フラスコから培養物を取り出し、1X PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。PBSをデカントし、約2分間プレートにトリプシンの1ミリリットルを追加します。フラスコ表面からセルを緩めるためにフラスコを軽くタップし、フラスコに5ミリリットルのRPMIメディアを追加します。細胞を収集し、15ミリリットルの円錐形のチューブにこの懸濁液を追加するために、上下にメディアをピペット。

1200 RPMで5分間遠心分離機にチューブを置きます。次に、チューブからメディアを取り外し、細胞ペレットを破壊しないようにします。チューブの底部をそっとフリックして細胞ペレットを破壊し、チューブに10ミリリットルのメディアを追加します。その後、メディアをゆっくりと上下にピペットし、細胞を懸濁液に入れます。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を決定し、元の細胞懸濁液の2ミリリットルを新しい15ミリリットルの円錐管に移す。チューブを遠心分離機に入れ、細胞を1200RPMで5分間ペレットします。遠心分離後、余分な媒体をチューブから廃棄物容器に注ぎます。簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。

次に、この特定の放射能専用のラボ空間に移動してクロム51を使用する準備をする。すべてのステップの間にクロム51の安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護、ならびにクロム51のサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも、汚染の可能性のあるスペースでサービスを提供する必要があります。

放射能を適切に使用するように設定したら、クロム51の100マイクロキュアをターゲット細胞懸濁液に直接加えます。次に、チューブに小さな放射性テープを追加して、サンプルとチューブが放射性であることを示します。リードシールドで37度のインキュベーターにチューブを入れ、1時間インキュベートし、15~20分ごとにチューブをフリックします。

標的細胞が標識している間、エフェクター細胞の単一細胞懸濁液を調出す。この例では、ヒト末梢血モノ核細胞、またはPDMCは、標準密度勾配遠心分離により全血から単離し、10〜6番目の濃度に5倍であった。このエフェクターセル懸濁液を使い捨て試薬貯蔵所に移し、この懸濁液の200マイクロリットルを96ウェルの丸底プレートの行Bの各ウェルに加えます。次に、プレートのGを通して行Cの各井戸にRPMIの100マイクロリットルを追加します。

さて、PBMCのシリアル希釈を行い、まず行Bのウェル内の100マイクロリットルの細胞を除去し、これを行Cに追加することによって、エフェクター細胞番号の範囲を持つために開始します。次いで、100マイクロリットルの細胞を行Cから行Dに移すことによってエフェクター細胞をさらに希釈し、シリアル希釈を続ける。行Gに達したら、ウェルから100マイクロリットルを移動し、その行の各ウェルに100マイクロリットルの最終容積を残します。次に、100マイクロリットルの組織培養培地を行Aのウェルに加え、標的細胞からのクロム51の自発的放出の制御として機能し、エフェクター細胞をこの行に添加してはならない。次に、ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。

インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5ミリリットルのFBSで洗浄し、過剰なクロム51を除去する。次に、チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200 rpmで5分間回転させます。放射性FBS洗浄を適切な廃棄物容器に取り出し、FBSの新鮮な5ミリリットルでペレットを再度サスペンドして洗浄工程を繰り返します。チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200 rpmで5分間再び回転させます。2回目の洗浄を取り外し、ガイガーカウンターを使用して放射能を取り込んだペレットを確認します。最後に、ペレットを完全培地の10ミリリットルで再懸濁し、標識されたクロム51を、標的細胞懸濁液を使い捨て試薬貯蔵所に注ぐ。次いで、これらの標識標的細胞の100マイクロリットルを96ウェルエフェクター細胞板の全ウェルに添加する。次に、1%NP-40の100マイクロリットルを行Hのウェルに水に加え、この各行のすべての標的細胞をlyseseする。これらのウェルは、1 分あたりの合計数 (cpm) を決定するコントロールとして使用されます。

プレートが準備されたので、プレートの両側に小さなテープを加えて蓋を固定し、クロム51が含まれていることを示すために蓋に放射性テープを置きます。次に、放射性サンプルを取り扱うマークが付いている遠心分離機にプレートを置きます。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。遠心分離機を1200rpmに設定し、プレートをスピードアップさせます。速度で一度、マシンを停止します。遠心分離機からプレートを取り出します。次に、プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、小さな鉛シールドをプレートの上に置き、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞がリズできるようにします。

インキュベーション期間の終わりに、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。約10秒後、綿栓の圧力を離し、綿のプラグをチューブストリップに移します。これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出されるクロム51の量を定量するためにサンプルを実行します。チューブがカウンターに積み込まれた順序を注意深く記録します。

ここでは、最初の3レーンに非刺激PBMCを追加し、CPG刺激PMBCをレーン4~6に追加しました。この例では、サンプルが元のプレートにレイアウトされ、三重の平均が計算されたのと同じ方法で、スプレッドシートのセルに 1 分あたりのカウントが入力されました。例えば、第1の条件について、細胞A1、A2、およびA3は、細胞I3において平均化された。平均が決定されると、各条件の特定のリシスの割合は、この式を使用して計算できます。例えば、50対1のエフェクター細胞の比率を有する非刺激細胞に対する比を計算するために、この例では1164.67である自発的なCPMを標的とする細胞に対して、実験CPM、1129から差し引いた。67. この数値を最大 CPM と自発的な CPM の差で割り、100 を掛けて特定のリシスの割合を与えることができます。これは、各条件に対して計算されます。次に、これらのデータをグラフ化して、非刺激PBMCとCPG刺激PBMCの両方に対する比比と比性リシスの比較を示すことができます。この例では、CPGで刺激されたエフェクター細胞は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が増加するにつれて、より効果的に標的細胞を殺した。この増加は、非刺激されたPBMCでは観察されなかったが、標的細胞リシスの観察増加のためにCPG刺激が必要であることを示す。

Results

この例では、CpGで刺激されたエフェクター細胞(図1、黒い円)は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が増加するにつれて、より効果的に標的細胞を殺した。この増加は、非刺激型PBMC(白色円)では観察されず、標的細胞リシスの観察増加にCpG刺激が必要であることを示す。

Figure 1
図1:51Crアッセイ散散散図:ヒトPBMCによる腫瘍活性、非刺激(白い円)およびCpG(黒い円)による刺激後、異なるエフェクターで試験:標的細胞比(E:T)比(範囲から範囲.50:1 から 1.5:1)。

Applications and Summary

ここで説明するアッセイは、様々なエフェクターおよび標的細胞が求められる質問に応じて使用することができるので、かなりの柔軟性を有する。例えば、エフェクター細胞特異性は、異なる標的細胞またはエフェクター細胞殺傷のメカニズムを使用して決定することができ、特定のタンパク質に欠乏した細胞を使用するか、またはタンパク質特異的阻害剤を使用して決定することができる。51Cr放出アッセイの大きな問題は、標的細胞による高い自発的放出率の可能性である。単独で培養した場合(エフェクター細胞を含まない)、標的細胞による51Crの自発的放出は、理想的には、標的細胞による全放出(「最大」)の30%以下であるべきである。より高い自発的放出率は、不健康な標的細胞を使用すること、健康状態の悪さ(例えば、細胞株の拡張培養)または過度に長い標識期間に起因する可能性がある。

References

  1. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
  2. Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

手順の概要

細胞死を測定するための典型的な51Cr放出アッセイには、次の手順が含まれます。

  1. まず、標的細胞にNa2[51Cr]O4で標識される。これは、アッセイ中のエフェクター細胞と区別する。
  2. 標的細胞が標識している間に、エフェクター細胞が集められ、シリアル希釈技術を用いて、エフェクター細胞の減少滴定が丸底96ウェルアッセイプレートに生成される。
  3. 標的細胞標識の終わりに、細胞が最初に洗浄され、次に一連のエフェクター細胞希釈を既に含むアッセイプレートに一定数の細胞が追加されます。
  4. 次に、標的エフェクター細胞ミックスを一定期間インキュベートし、標的細胞との十分な細胞相互作用を可能にし、細胞リシスを媒介する。
  5. 最後に、培養上清を採取し、チューブに集化する。51Cr量は、ガンマカウンタを用いて定量される。
  6. 最後に、データが収集され、ターゲット細胞の「パーセンテージ特定細胞リシス」を計算するために使用されます。

1. 51Crでターゲットセルを標識する

  1. 開始するには、標的細胞を、(ここでヒト黒色腫細胞株WM793)を、単一細胞懸濁液に調製する。
  2. これを行うには、まず組織培養フラスコから培中を取り除きます。
  3. 次いで、1X PBSの5mLで細胞を洗浄する。
  4. プレートに1mLのトリプシンを2分間添加して細胞をトリプシン化する。
  5. フラスコを軽くタップして、フラスコ表面からセルを緩めます。
  6. フラスコに 5 mL の RPMI メディアを追加し、メディアを上下にピプテしてセルを取り外します。
  7. セル懸濁液を15mLの円錐管に集め、1200rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離します。上清をデカント。
  8. ペレットに10mLのメディアを追加し、メディアを上下に優しくピプテリングして細胞を懸濁液に入します。
  9. 血球計を用いて細胞濃度を決定する。
  10. 1x106セルを新しい15 mL円錐管に移します。
  11. 1200 rpmで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清をデカントする。
  12. 簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。
  13. 51 Crの100μCiをWM793ターゲット細胞懸濁液に直接追加します。
    注:特定の放射能に専用のラボスペースを設置する必要があります。さらに、すべてのステップの間に51Crの安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護および51Crが付いているサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも必要です。
  14. チューブに小さな放射性テープを追加して、チューブが放射性であることを示します。
  15. リードシールドを使用してチューブを37°Cのインキュベーターに入れ、1時間インキュベートして15~20分ごとにチューブをフリックし、クロムの標的細胞取り込み量を増やします。
  16. インキュベーション期間の後、5mLのFBSで標的細胞を洗浄し、余分な51Crを除去する。
  17. 1200rpmで細胞を5分間遠心分離し、放射性FBSを適切な廃棄物容器に洗浄します。
  18. ペレットを再度中断し、FBSでもう一度洗います。ガイガーカウンターを使用して、組み込まれた放射能のペレットを確認してください。
  19. ペレットを10mL完全培地で再ステージングし、105セル/mLの細胞濃度を達成した。
    注:51Cr標識後の細胞計数ステップは、安全上の理由からここで大きく省略されている。WM793細胞濃度は、51Cr標識以前と同じであると仮定することができる。

2. エフェクターセルの準備

  1. 様々なエフェクター細胞を用いることができるのは、ヒトまたはマウスT細胞およびNK細胞などである。この例では、PBMCは、標準密度勾配遠心分離(5x106の濃度)によって全血から単離され、使用された。
  2. まず、96ウェルの丸底プレートの行の1つのウェル(ここでは行A、表1を参照)に100 μLの組織培養培地を追加します。ここでは、エフェクター細胞は追加されなく、標的細胞からの「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」として機能します。

Figure 1
表1:51Cr放出アッセイレイアウト:行A-標的細胞(104細胞/100μL)を媒体のみでインキュベートした(「最小/自発的51Cr放出」を決定するための「ブランク」を生成する)。異なるエフェクタを含む行B から C ウェル:ターゲット セル (E:T) 比(50:1 ~ 1.5:1) 。行H-標的細胞(104細胞/100μL)を1%NP-40でインキュベート(NP-40は標的細胞をlyss)し、「最大または合計51Cr放出」を生成する。すべてのE:T比は、すべての実験条件に対して三重で試験される。列1-3-非刺激 PBMC およびカラム4-6- CpG 刺激 PBMC。

  1. 次に、PBMCの2Xシリアル細胞希釈(各実験条件に対して三重に)を生成し、5x10 5〜15,625細胞/100μLの培ブレン(ここではB~G行)のエフェクター細胞濃度を得る。
    注:この例では、開始エフェクタ:ターゲットセル(E:T)比は50:1です。ただし、この比率は実験の詳細に応じて調整できます。
  2. これらのウェルにエフェクターセルを追加しないことで、最後の行を空のままにしておきます(ここでは行H)。(この行は、「合計カウント/分、または (c. p. m)」または「最大51Cr リリース」を生成するために使用されます。
  3. ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。

3. アッセイに51Cr標識WM793ターゲットセルを追加する

  1. インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5mLのFBSで洗浄し、余分な51Crを除去する。
  2. 指定された遠心分離機を使用して、1200 rpmで5分間細胞を遠心分離する。
  3. FBS洗浄(放射性上清)を適切な廃棄物容器に取り出します。
  4. FBSの新鮮な5 mLでペレットを再中断することによって洗浄工程を繰り返します。
  5. 細胞を1200 rpmで5分間遠心分離します。
  6. 最後に、ペレットを10mLの完全培地で再中断する。
  7. 51CrラベルWM793細胞懸濁液(105セル/mL)を使い捨て試薬貯蔵所に注ぎます。
  8. 次いで、これらの標識標的細胞の100μLを、96ウェルエフェクター細胞板の各ウェルに、マルチチャネルピペットを用いて加える。
  9. 次に、エフェクター細胞を欠いている井戸の列に1%NP-40(水中)の100 μLを加えます(ここでは行H)。1% NP-40は標的細胞をlyseし、したがって、これらのウェルは、「合計カウント/分、または(c.p.m)」または最大51Cr放出を決定するためのコントロールとして機能します。
  10. プレートの両側にガス透過性テープの小片を追加してプレートに蓋を固定し、51Crが含まれていることを示すために蓋に放射性テープの一部を置きます。
  11. 簡単に言えば、1200 rpmでプレートを遠心分離します。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。
    注:放射性サンプルを取り扱うには、遠心分離機を使用することが重要です。
  12. 遠心分離機からプレートを取り出します。
  13. プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、プレートの上に小さな鉛シールドを施し、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞リシスを可能にする。
    注:インキュベーション期間は、使用されるエフェクター細胞および使用される殺戮の潜在的なメカニズムに応じて4〜18時間に変化しうる。

4. 上清の収穫

  1. インキュベーション期間の終わりには、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。
  2. 次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。これにより、無細胞の上清のコレクションが保証されます。
  3. 今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。
  4. 約10秒後、綿栓の圧力を解放し、綿のプラグをチューブストリップに移します。
  5. これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。
  6. 最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出される51Crの量を定量するためにサンプルを実行します。サンプルは通常1分間測定され、「カウント/分」を容易に決定することができます。
  7. 慎重に、チューブがカウンターにロードされた順序を記録します。

5. データ分析

  1. ここでは、最初の3列に非刺激PBMCを追加し、CpG刺激型PBMC(CpG ODN、24時間(1μg/mL))をカラム4-6に添加した。表 2 を参照してください。
1 2 3 4 5 6 7 8
A 1251 1157 1086 917 1118 1140
B 1832 1986 1971 7629 7913 8180
C 1677 1739 1428 5454 5055 5268
D 1638 1552 1734 4239 3582 3786
E 1658 1580 1339 2818 2623 2750
F 1579 1472 1483 2028 1779 1769
G 1326 1325 1184 1801 1654 1565
H 9220 9367 8067 8774 9647 8236
A1,A2,A3の平均 1164.67 自発的な午後 1058.33
J 平均 B1,B2,B3 -> 1929.67 9.91% 7907.33 87.50% 50:1
K C1,C2,C3の平均 1614.67 5.83% 5259 53.67% 25:1
L D1,D2,D3の平均 1641.33 6.17% 3869 35.91% 12.5:1
M E1,E2,E3の平均 1525.67 4.68% 2730.33 21.36% 6.25:1
N F1,F2,F3の平均 1511.33 4.49% 1858.67 10.22% 3.12:1
O G1,G2,G3の平均 1278.33 1.47% 1673.33 7.86% 1.56:1
P H1,H2,H3の平均 8884.67 最大 c.p.m 8885.67
アンスティム PBMC CpG-スティム PBMC E:T比

表 2: 51Cr リリースアッセイ データ:'1 分あたりのカウント' / 'c. p. m' データ値、平均 c. p. m 値、および計算されたパーセント特定の lysis 値。

  1. 収集されたデータ(1分あたりのカウント、すなわちc.p.m)は、サンプルが元のプレートにレイアウトされたのと同じ方法でスプレッドシートのセルに入力されました。
  2. まず、三位一体の平均を算出した。表2-細胞I3〜P3、非刺激PBMCおよび細胞I6~P6について、CpG刺激PBMCについて。
  3. 平均が決定されると、各条件に対する特定のリシスの割合は、以下の式を使用して計算された。

  4. 特定のリシスの割合は、各条件について計算した(表2 -細胞J4からO4、未刺激PBMCおよびJ7からO7、非刺激PBMCについて)。

このビデオでは、クロム放出アッセイを実行し、エフェクター細胞の細胞毒性電位を決定する方法を観察します。

免疫細胞は、がんやウイルスに感染した細胞などの潜在的に有害な細胞を体から同定し、除去する役割を担っています。T細胞やNK細胞のようないくつかの免疫細胞は、細胞傷害性電位として知られている性質を有し、標的細胞を同定し、タンパク質の分解、リシス、およびそれらの標的細胞の死を誘発するタンパク質を分泌する能力である。細胞傷害性の定量化は、免疫細胞の活性化と効力を測定するために重要であり、クロム放出アッセイは、この目的のために一般的に使用されます。

この方法は、ユーザーが異なる条件下で特定の種類の免疫細胞によって誘発されるシキシック度を比較することを可能にし、癌免疫療法および免疫関連疾患の研究に有益である。まず、標的細胞は、癌細胞と同様に、細胞によって取り込まれる放射性同位元素、クロム51でインキュベートされる。次に、これらの無線標識細胞は、目的の単離された免疫細胞と共培養され、エフェクター細胞とも呼ばれ、丸底に、96-ウェルプレートで2つの細胞型間の相互作用を容易にする。

アッセイの全体的なセットアップは、適切なコントロールと共に、免疫細胞の異なる濃度を有する特定の数の標的細胞をインキュベートすることを含む。この共培養により、エフェクター細胞は標的細胞にアポトーシスおよび溶解を誘導し、その結果、細胞内クロム51を上清中に放出する。次に、あらかじめ最適化された時点で、放出されたクロムを含む上清が全てのウェルから採取される。クロム51は、放射性である、自発的にガンマ放射線を放出するために放射性崩壊を受ける。アッセイプレート内のすべてのウェルからの上清中のガンマ放射線レベルは、標的細胞のリシスの定量可能な出力を表す。これはガンマカウンターを使用して測定され、免疫細胞の細胞毒性電位を決定するために使用されます。

まず、標的細胞は、この例ではヒト黒色腫細胞株WM793を、単一細胞懸濁液に調製する。これを行うには、まず組織培養フラスコから培養物を取り出し、1X PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。PBSをデカントし、約2分間プレートにトリプシンの1ミリリットルを追加します。フラスコ表面からセルを緩めるためにフラスコを軽くタップし、フラスコに5ミリリットルのRPMIメディアを追加します。細胞を収集し、15ミリリットルの円錐形のチューブにこの懸濁液を追加するために、上下にメディアをピペット。

1200 RPMで5分間遠心分離機にチューブを置きます。次に、チューブからメディアを取り外し、細胞ペレットを破壊しないようにします。チューブの底部をそっとフリックして細胞ペレットを破壊し、チューブに10ミリリットルのメディアを追加します。その後、メディアをゆっくりと上下にピペットし、細胞を懸濁液に入れます。次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を決定し、元の細胞懸濁液の2ミリリットルを新しい15ミリリットルの円錐管に移す。チューブを遠心分離機に入れ、細胞を1200RPMで5分間ペレットします。遠心分離後、余分な媒体をチューブから廃棄物容器に注ぎます。簡単に残された媒体の小容量で細胞ペレットを再中断するためにチューブを渦。

次に、この特定の放射能専用のラボ空間に移動してクロム51を使用する準備をする。すべてのステップの間にクロム51の安全な貯蔵および使用のための十分な鉛の保護、ならびにクロム51のサンプルが保管されている場所を示す適切な看板がある必要があります。パンケーキプローブを装備したガイガーカウンターも、汚染の可能性のあるスペースでサービスを提供する必要があります。

放射能を適切に使用するように設定したら、クロム51の100マイクロキュアをターゲット細胞懸濁液に直接加えます。次に、チューブに小さな放射性テープを追加して、サンプルとチューブが放射性であることを示します。リードシールドで37度のインキュベーターにチューブを入れ、1時間インキュベートし、15~20分ごとにチューブをフリックします。

標的細胞が標識している間、エフェクター細胞の単一細胞懸濁液を調出す。この例では、ヒト末梢血モノ核細胞、またはPDMCは、標準密度勾配遠心分離により全血から単離し、10〜6番目の濃度に5倍であった。このエフェクターセル懸濁液を使い捨て試薬貯蔵所に移し、この懸濁液の200マイクロリットルを96ウェルの丸底プレートの行Bの各ウェルに加えます。次に、プレートのGを通して行Cの各井戸にRPMIの100マイクロリットルを追加します。

さて、PBMCのシリアル希釈を行い、まず行Bのウェル内の100マイクロリットルの細胞を除去し、これを行Cに追加することによって、エフェクター細胞番号の範囲を持つために開始します。次いで、100マイクロリットルの細胞を行Cから行Dに移すことによってエフェクター細胞をさらに希釈し、シリアル希釈を続ける。行Gに達したら、ウェルから100マイクロリットルを移動し、その行の各ウェルに100マイクロリットルの最終容積を残します。次に、100マイクロリットルの組織培養培地を行Aのウェルに加え、標的細胞からのクロム51の自発的放出の制御として機能し、エフェクター細胞をこの行に添加してはならない。次に、ターゲットセルを追加する準備ができるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。

インキュベーション期間の後、インキュベーターから標的細胞を除去し、5ミリリットルのFBSで洗浄し、過剰なクロム51を除去する。次に、チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200 rpmで5分間回転させます。放射性FBS洗浄を適切な廃棄物容器に取り出し、FBSの新鮮な5ミリリットルでペレットを再度サスペンドして洗浄工程を繰り返します。チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200 rpmで5分間再び回転させます。2回目の洗浄を取り外し、ガイガーカウンターを使用して放射能を取り込んだペレットを確認します。最後に、ペレットを完全培地の10ミリリットルで再懸濁し、標識されたクロム51を、標的細胞懸濁液を使い捨て試薬貯蔵所に注ぐ。次いで、これらの標識標的細胞の100マイクロリットルを96ウェルエフェクター細胞板の全ウェルに添加する。次に、1%NP-40の100マイクロリットルを行Hのウェルに水に加え、この各行のすべての標的細胞をlyseseする。これらのウェルは、1 分あたりの合計数 (cpm) を決定するコントロールとして使用されます。

プレートが準備されたので、プレートの両側に小さなテープを加えて蓋を固定し、クロム51が含まれていることを示すために蓋に放射性テープを置きます。次に、放射性サンプルを取り扱うマークが付いている遠心分離機にプレートを置きます。実験プレートが 1 つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス プレートを追加します。遠心分離機を1200rpmに設定し、プレートをスピードアップさせます。速度で一度、マシンを停止します。遠心分離機からプレートを取り出します。次に、プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、小さな鉛シールドをプレートの上に置き、安全性を高めます。16時間インキュベートして、標的細胞がリズできるようにします。

インキュベーション期間の終わりに、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。次に、収穫フレームをプレート上に置き、綿栓ごとに小さなフィルターディスクが設置されていることを確認します。今、ゆっくりと穏やかに井戸に綿のプラグを押します。約10秒後、綿栓の圧力を離し、綿のプラグをチューブストリップに移します。これらのチューブをそれぞれ二次 FACS チューブに入れます。最後に、FACSチューブをガンマカウンターにロードし、各条件で放出されるクロム51の量を定量するためにサンプルを実行します。チューブがカウンターに積み込まれた順序を注意深く記録します。

ここでは、最初の3レーンに非刺激PBMCを追加し、CPG刺激PMBCをレーン4~6に追加しました。この例では、サンプルが元のプレートにレイアウトされ、三重の平均が計算されたのと同じ方法で、スプレッドシートのセルに 1 分あたりのカウントが入力されました。例えば、第1の条件について、細胞A1、A2、およびA3は、細胞I3において平均化された。平均が決定されると、各条件の特定のリシスの割合は、この式を使用して計算できます。例えば、50対1のエフェクター細胞の比率を有する非刺激細胞に対する比を計算するために、この例では1164.67である自発的なCPMを標的とする細胞に対して、実験CPM、1129から差し引いた。67. この数値を最大 CPM と自発的な CPM の差で割り、100 を掛けて特定のリシスの割合を与えることができます。これは、各条件に対して計算されます。次に、これらのデータをグラフ化して、非刺激PBMCとCPG刺激PBMCの両方に対する比比と比性リシスの比較を示すことができます。この例では、CPGで刺激されたエフェクター細胞は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が増加するにつれて、より効果的に標的細胞を殺した。この増加は、非刺激されたPBMCでは観察されなかったが、標的細胞リシスの観察増加のためにCPG刺激が必要であることを示す。

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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