Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Source : Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3, et Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Microbiologie, immunologie et programme d’études supérieures en biologie du cancer, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Département d’urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Une des principales fonctions des cellules du système immunitaire est d’enlever les cellules cibles qui ont été infectées par des virus ou ont subi une transformation en une cellule tumorale. Les tests in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules immunitaires sont un aliment de base dans les laboratoires depuis de nombreuses années. Ces essais ont été utilisés pour déterminer la capacité des lymphocytes T, des cellules NK, ou de toute autre cellule immunitaire à tuer les cellules cibles d’une manière spécifique à l’antigène ou non spécifique. Les ligands de la mort (p. ex. Fas ligand ou TRAIL), les cytokines (p. ex. IFNg ou TNF) ou les granules cytotoxiques (p. ex., perforine/granzyme B) exprimés par les cellules effectrices sont quelques façons d’intenter l’induit de la mort cellulaire cible. Avec l’explosion de la recherche d’immunothérapie de tumeur ces dernières années, il y a l’intérêt croissant dans trouver des agents pour augmenter l’activité cytotoxique des cellules immunitaires pour améliorer des résultats patients. Inversement, certaines maladies sont marquées par l’activité surexubérante de l’activité cytotoxique des cellules immunitaires, ce qui entraîne des efforts pour identifier les agents pour tempérer ces réponses. Ainsi, avoir un test dans lequel l’utilisateur peut facilement intégrer un certain nombre de cellules effectrices différentes, cellules cibles, et / ou modificateurs de réponse dans la conception expérimentale peut servir de moyen précieux d’évaluer rapidement la capacité cytotoxique des cellules effectrices et / ou la réactivité de la cellule cible.

Ces essais in vitro impliquent le mélange de différentes populations cellulaires, ainsi que l’utilisation d’un nombre relativement faible de cellules effectrices et cibles. Ainsi, l’une des nécessités de l’analyse est d’étiqueter les cellules cibles d’une manière qui peut facilement être détectée et quantit, permettant à l’utilisateur de déterminer ensuite la « lyse spécifique pour cent » médiée par les cellules effectrices. La radioactivité – en particulier, le chrome 51 (⁵¹Cr) sous la forme de Na₂⁵¹CrO₄– est un moyen peu coûteux d’étiqueter rapidement et non spécifiquement les protéines cellulaires dans les cellules cibles (1). L’étiquetage court et les temps d’assiduité total réduisent le risque de changements significatifs dans le nombre et/ou le phénotype des cellules cibles, ce qui pourrait influencer le résultat de l’effort. Lors de la perte de l’intégrité de la membrane des cellules cibles en raison de l’activité cytotoxique des cellules effectrices, les ⁵¹protéines cellulaires étiquetées Cr dans les cellules cibles sont libérées dans le supernatant de culture, devenant disponibles pour Quantification. Comme avec tout analyse examinant la fonction des cellules immunitaires in vitro,il ya un certain nombre de considérations importantes à envisager d’améliorer la performance de l’expérience. Une des caractéristiques les plus critiques est d’utiliser l’effecteur sain (pour l’activité cytotoxique maximale) et la cible (pour la réactivité maximale et la mort spontanée minimale /⁵¹Cr libération) cellules. Le contact entre l’effet et les cellules cibles est nécessaire (ce qui conduit à l’utilisation courante de plaques rondes de 96 puits pour encourager le contact cellule-cellule) (2). Enfin, l’analyse des données dépend de l’inclusion de populations de cellules cibles de contrôle positives et négatives.

Le protocole suivant exposera les étapes pour effectuer un jeu standard de libération ^{de 51}Cr pour mesurer la capacité cytotoxique d’une population de cellules effectrices, bien qu’une version non radioactive utilisant europium ait été récemment développée. ^{51 Annonces} Cr est un puissant émetteur de rayonnement. Par conséquent, l’utilisation de cet analyse nécessite une formation appropriée en matière de sécurité des rayonnements, un espace de laboratoire dédié, un compteur gamma et l’élimination d’échantillons radioactifs.

La séquence générale des événements dans cet état d’œil est la suivante : 1) préparer ⁵¹cibles étiquetées Cr; 2) préparer les cellules effectrices et les ajouter à la plaque pendant que les cellules cibles sont étiquetées; 3) ajouter des cibles étiquetées à la plaque; 4) plaque incubée; 5) les supernatants de récolte ; et 6) analyser les données après l’exécution d’échantillons sur le comptoir. Les échantillons sont généralement préparés en triple, puis en moyenne pour tenir compte de toute différence subtile de pipetage.

Un EPI approprié est important pour cet avertissement. Plus précisément, l’utilisateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants. Des lunettes de sécurité peuvent être requises en fonction du laboratoire ou de l’établissement. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage sûr et l’utilisation de la ⁵¹Cr pendant toutes les étapes. Enfin, il devrait y avoir un espace de laboratoire et de l’équipement dédiés réservés à l’utilisation de ⁵¹Cr, y compris toutes les signalisations appropriées pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés et un compteur Geiger équipé d’une sonde gamma pour étudier l’espace pour possible contamination.

Dans cet exercice de laboratoire, nous déterminerons la capacité des cellules mononucléaires périphériques humaines de sang (PBMCs), (CpG stimulées contre non stimulées) pour tuer des cellules de mélanome, utilisant la ligne humaine de cellules de mélanome WM793 comme modèle et l’essai de libération de chrome.