Die Glykolyse beginnt mit einem einzelnen Glukosemolekül. Unter Verwendung von ATP überträgt das Enzym Hexokinase eine Phosphatgruppe auf den Sechs-Kohlenstoff-Zucker, um Glucose-6-phosphat zu produzieren, das aufgrund seiner negativen Ladung in der Zelle eingeschlossen wird. Als nächstes katalysiert das Enzym Phosphoglucose-Isomerase die Umwandlung der Phosphoglucose in eines ihrer Isomere, Fructose-6-phosphat. Die Phosphofructose kann nun durch ein geschwindigkeitsbegrenzendes Enzym, Phosphofructokinase, phosphoryliert werden, um Fructose-1,6-bisphosphat herzustellen. Schließlich wird mit zwei gebundenen Phosphatgruppen das Zuckermolekül durch Aldolase in zwei 3-Kohlenstoff-Isomere gespalten, Glycerinaldehyd-3-phosphat oder G3P und Dihydroxyacetonphosphat, DHAP. Ein anderes katalysierendes Enzym Triosephosphat-Isomerase wandelt das DHAP in G3P um, um zwei Moleküle zu erhalten. Während dieser Energieinvestitionsphase werden also insgesamt zwei ATPs verwendet, um ein anfängliches Glucosemolekül in zwei kleinere Zucker aufzuspalten.